La malaltia d'Alzheimer (MA) no té biomarcadors proteics que reflecteixin la seva múltiple fisiopatologia subjacent, dificultant el progrés del diagnòstic i el tractament. Aquí, utilitzem proteòmica integral per identificar biomarcadors de líquid cefaloraquidi (LCR) que representen una àmplia gamma de fisiopatologia de la MA. L'espectrometria de masses multiplex va identificar aproximadament 3.500 i aproximadament 12.000 proteïnes a l'AD CSF i al cervell, respectivament. L'anàlisi de xarxa del proteoma cerebral va resoldre 44 mòduls de biodiversitat, 15 dels quals es van solapar amb el proteoma del líquid cefaloraquidi. Els marcadors de CSF AD d'aquests mòduls superposats es pleguen en cinc grups de proteïnes, que representen diferents processos fisiopatològics. Les sinapsis i els metabòlits del cervell d'AD disminueixen, però el LCR augmenta, mentre que la mielinització i els grups immunitaris rics en glials al cervell i el LCR augmenten. La consistència i l'especificitat de la malaltia dels canvis del panell es van confirmar en més de 500 mostres addicionals de LCR. Aquests grups també van identificar subgrups biològics en la MA asimptomàtica. En general, aquests resultats són un pas prometedor cap a eines de biomarcadors basades en web per a aplicacions clíniques en la MA.
La malaltia d'Alzheimer (MA) és la causa més freqüent de demència neurodegenerativa a tot el món i es caracteritza per una àmplia gamma de disfuncions del sistema biològic, inclosa la transmissió sinàptica, la immunitat mediada per la glia i el metabolisme mitocondrial (1-3). Tanmateix, els seus biomarcadors de proteïnes establerts encara se centren en la detecció de proteïnes amiloides i tau i, per tant, no poden reflectir aquesta fisiopatologia diversa. Aquests biomarcadors de proteïnes "nuclis" que es mesuren de manera més fiable al líquid cefaloraquidi (LCR) inclouen (i) el pèptid beta amiloide 1-42 (Aβ1-42), que reflecteix la formació de plaques amiloides corticals; (ii) tau total, signe de degeneració axonal; (iii) fosfo-tau (p-tau), un representant de la hiperfosforilació patològica de tau (4-7). Tot i que aquests biomarcadors de líquid cefaloraquidi han facilitat molt la nostra detecció de malalties de proteïnes de l'AD "marcades" (4-7), només representen una petita part de la complexa biologia que hi ha darrere de la malaltia.
La manca de diversitat fisiopatològica dels biomarcadors d'AD ha comportat molts reptes, incloent (i) la incapacitat per identificar i quantificar l'heterogeneïtat biològica dels pacients amb AD, (ii) la mesura insuficient de la gravetat i la progressió de la malaltia, especialment en l'etapa preclínica, i (ii) iii) el desenvolupament de fàrmacs terapèutics que no van poder resoldre completament tots els aspectes del deteriorament neurològic. La nostra dependència de la patologia històrica per descriure l'AD de malalties relacionades només agreuja aquests problemes. Cada cop hi ha més evidències que mostren que la majoria de les persones grans amb demència tenen més d'una característica patològica de deteriorament cognitiu (8). Fins al 90% o més de les persones amb patologia de la MA també tenen malalties vasculars, inclusions de TDP-43 o altres malalties degeneratives (9). Aquestes altes proporcions de solapament patològic han alterat el nostre marc diagnòstic actual de la demència, i cal una definició fisiopatològica més completa de la malaltia.
Atesa la necessitat urgent d'una varietat de biomarcadors d'AD, el camp adopta cada cop més el mètode "òmic" basat en el sistema global per descobrir biomarcadors. L'Aliança Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD es va posar en marxa el 2014 i està al capdavant del programa. Aquest esforç multidisciplinari dels Instituts Nacionals de Salut, l'acadèmia i la indústria té com a objectiu utilitzar estratègies basades en sistemes per definir millor la fisiopatologia de la MA i desenvolupar estratègies de tractament i anàlisi de diagnòstic de la biodiversitat (10). Com a part d'aquest projecte, la proteòmica de xarxa s'ha convertit en una eina prometedora per a l'avenç de biomarcadors basats en sistemes en la MA. Aquest enfocament imparcial basat en dades organitza conjunts complexos de dades de proteòmica en grups o "mòduls" de proteïnes coexpressades que s'associen a tipus de cèl·lules, orgànuls i funcions biològiques específiques (11-13). S'han realitzat gairebé 12 estudis de proteòmica de xarxa rica en informació sobre el cervell de l'AD (13-23). En general, aquestes anàlisis indiquen que el proteoma de la xarxa cerebral AD manté una organització modular molt conservada en cohorts independents i múltiples regions corticals. A més, alguns d'aquests mòduls mostren canvis reproduïbles en l'abundància relacionada amb l'AD en conjunts de dades, que reflecteixen la fisiopatologia de múltiples malalties. Col·lectivament, aquestes troballes demostren un punt d'ancoratge prometedor per al descobriment del proteoma de la xarxa cerebral com a biomarcador basat en el sistema en l'AD.
Per transformar el proteoma de la xarxa cerebral de l'AD en biomarcadors clínicament útils basats en el sistema, vam combinar la xarxa derivada del cervell amb l'anàlisi proteòmica de l'AD CSF. Aquest enfocament integrat va conduir a la identificació de cinc conjunts prometedors de biomarcadors de LCR que estan associats amb una àmplia gamma de fisiopatologia basada en el cervell, com ara sinapsis, vasos sanguinis, mielinització, inflamació i disfunció de les vies metabòliques. Hem validat amb èxit aquests panells de biomarcadors mitjançant múltiples anàlisis de replicació, incloses més de 500 mostres de LCR de diverses malalties neurodegeneratives. Aquestes anàlisis de validació inclouen examinar objectius grupals en el LCR de pacients amb AD asimptomàtica (AsymAD) o mostrar evidències d'acumulació anormal d'amiloide en un entorn cognitiu normal. Aquestes anàlisis posen de manifest l'heterogeneïtat biològica significativa de la població d'AsymAD i identifiquen marcadors de panell que poden ser capaços de subtipificar individus en les primeres etapes de la malaltia. En general, aquests resultats representen un pas clau en el desenvolupament d'eines de biomarcadors de proteïnes basades en múltiples sistemes que poden resoldre amb èxit molts dels reptes clínics als quals s'enfronta l'AD.
L'objectiu principal d'aquest estudi és identificar nous biomarcadors de líquid cefaloraquidi que reflecteixin diverses fisiopatologies basades en el cervell que condueixen a la MA. La figura S1 descriu la nostra metodologia de recerca, que inclou (i) una anàlisi exhaustiva impulsada per les troballes preliminars de l'AD CSF i el proteoma del cervell de xarxa per identificar múltiples biomarcadors de la malaltia del LCR relacionats amb el cervell i (ii) la replicació posterior. cohorts fluides. La investigació orientada al descobriment va començar amb l'anàlisi de l'expressió diferencial de LCR en 20 individus cognitivament normals i 20 pacients amb AD al Centre d'Investigació de la Malaltia d'Alzheimer d'Emory Goizueta (ADRC). El diagnòstic d'AD es defineix com un deteriorament cognitiu significatiu en presència d'Aβ1-42 baix i nivells elevats de tau total i p-tau al líquid cefaloraquidi [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA). )]] (Taula S1A). El control (MoCA mitjà, 26,7 ± 2,2) tenia nivells normals de biomarcadors de LCR.
El LCR humà es caracteritza per un rang dinàmic d'abundància de proteïnes, en què l'albúmina i altres proteïnes extremadament abundants poden evitar la detecció de proteïnes d'interès (24). Per augmentar la profunditat del descobriment de proteïnes, vam eliminar les primeres 14 proteïnes altament abundants de cada mostra de CSF abans de l'anàlisi d'espectrometria de masses (MS) (24). Es van identificar un total de 39.805 pèptids per MS, que es van mapar a 3.691 proteomes en 40 mostres. La quantificació de proteïnes es realitza mitjançant l'etiquetatge d'etiquetes de massa en tàndem múltiple (TMT) (18, 25). Per tal de resoldre les dades que falten, vam incloure només aquelles proteïnes que es van quantificar en almenys el 50% de les mostres en l'anàlisi posterior, per la qual cosa finalment es van quantificar 2875 proteomes. A causa de la diferència significativa en els nivells d'abundància total de proteïnes, una mostra de control es va considerar estadísticament un valor atípic (13) i no es va incloure en l'anàlisi posterior. Els valors d'abundància de les 39 mostres restants es van ajustar segons l'edat, el gènere i la covariància del lot (13-15, 17, 18, 20, 26).
Utilitzant l'anàlisi estadística de la prova t per avaluar l'expressió diferencial al conjunt de dades de regressió, aquesta anàlisi va identificar proteïnes els nivells d'abundància de les quals es van canviar significativament (P <0, 05) entre els casos control i AD (taula S2A). Com es mostra a la figura 1A, l'abundància d'un total de 225 proteïnes a l'AD es va reduir significativament i l'abundància de 303 proteïnes es va augmentar significativament. Aquestes proteïnes expressades de manera diferent inclouen diversos marcadors d'AD del líquid cefaloraquidi identificats prèviament, com ara la proteïna tau associada a microtúbuls (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3), proteïna relacionada amb el creixement 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), proteïna d'unió d'àcids grassos 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), quitinasa 3 com 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), granulina neural (NRGN; P = 3,43 × 10−4) i factor de creixement nerviós VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Tanmateix, també hem identificat altres objectius molt importants, com l'inhibidor de la dissociació del PIB 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) i la unió de calci modular relacionada amb SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). L'anàlisi d'ontologia gènica (GO) de 225 proteïnes reduïdes significativament va revelar connexions estretes amb processos de fluids corporals com el metabolisme dels esteroides, la coagulació de la sang i l'activitat hormonal (figura 1B i taula S2B). En canvi, la proteïna augmentada significativament de 303 està estretament relacionada amb l'estructura cel·lular i el metabolisme energètic.
(A) El gràfic del volcà mostra el canvi de vegades log2 (eix x) en relació amb el valor P estadístic -log10 (eix y) obtingut per la prova t, que s'utilitza per detectar l'expressió diferencial entre el control (CT) i Casos d'AD del proteoma LCR De totes les proteïnes. Les proteïnes amb nivells significativament reduïts (P <0, 05) en AD es mostren en blau, mentre que les proteïnes amb nivells significativament augmentats de malaltia es mostren en vermell. La proteïna seleccionada està marcada. (B) Els termes GO principals relacionats amb la proteïna es redueixen significativament (blau) i augmenten (vermell) a l'AD. Mostra els tres termes GO amb les puntuacions z més altes en els camps de processos biològics, funcions moleculars i components cel·lulars. (C) MS va mesurar el nivell de MAPT a la mostra de CSF (esquerra) i la seva correlació amb el nivell tau ELISA de la mostra (dreta). Es mostra el coeficient de correlació de Pearson amb el valor P rellevant. A causa de la manca de dades ELISA per a un cas d'AD, aquestes xifres inclouen valors per a 38 dels 39 casos analitzats. ( D ) Anàlisi de clúster supervisada (P <0, 0001, Benjamini-Hochberg (BH) ajustat P <0, 01) al control i AD CSF van trobar mostres utilitzant les 65 proteïnes que van canviar més significativament del conjunt de dades. Normalitzar, normalitzar.
El nivell proteòmic de MAPT està estretament relacionat amb el nivell tau ELISA mesurat de manera independent (r = 0, 78, P = 7, 8 × 10-9; Figura 1C), donant suport a la validesa de la nostra mesura de MS. Després de la digestió de tripsina a nivell de proteïna precursora d'amiloide (APP), els pèptids específics de la isoforme mapejats a l'extrem C-terminal d'Aβ1-40 i Aβ1-42 no es poden ionitzar de manera eficient (27, 28). Per tant, els pèptids APP que hem identificat no tenen res a veure amb els nivells d'ELISA Aβ1-42. Per avaluar l'expressió diferencial de cada cas, hem utilitzat proteïnes expressades de manera diferencial amb P <0, 0001 [taxa de descobriment fals (FDR) corregida P <0, 01] per realitzar una anàlisi de clúster supervisada de les mostres (taula S2A). Com es mostra a la figura 1D, aquestes 65 proteïnes altament significatives poden agrupar correctament mostres segons l'estat de la malaltia, excepte un cas d'AD amb característiques semblants al control. D'aquestes 65 proteïnes, 63 van augmentar en AD, mentre que només dues (CD74 i ISLR) van disminuir. En total, aquestes anàlisis de líquid cefaloraquidi han identificat centenars de proteïnes en l'AD que poden servir com a biomarcadors de malalties.
A continuació, vam realitzar una anàlisi de xarxa independent del proteoma cerebral AD. La cohort cerebral d'aquest descobriment incloïa l'escorça prefrontal dorsolateral (DLPFC) dels casos de control (n = 10), malaltia de Parkinson (PD; n = 10), casos mixts d'AD/PD (n = 10) i AD (n = 10). ) Mostra. Emery Goizueta ADRC. La demografia d'aquests 40 casos s'ha descrit prèviament (25) i es resumeix a la taula S1B. Hem utilitzat TMT-MS per analitzar aquests 40 teixits cerebrals i la cohort de replicació de 27 casos. En total, aquests dos conjunts de dades cerebrals van produir 227.121 pèptids únics, que es van mapar a 12.943 proteomes (25). Només les proteïnes que es van quantificar en almenys el 50% dels casos es van incloure en investigacions posteriors. El conjunt de dades final del descobriment conté 8817 proteïnes quantificades. Ajusteu els nivells d'abundància de proteïnes en funció de l'edat, el gènere i l'interval post mortem (PMI). L'anàlisi d'expressió diferencial del conjunt de dades després de la regressió va mostrar que > 2000 nivells de proteïnes es van canviar significativament [P <0, 05, anàlisi de la variància (ANOVA)] en dues o més cohorts de malalties. A continuació, vam realitzar una anàlisi de clúster supervisada basada en les proteïnes expressades de manera diferencial i P <0, 0001 en comparacions AD/control i/o AD/PD (figura S2, A i B, taula S2C). Aquestes 165 proteïnes altament alterades representen clarament casos amb patologia d'AD a partir de les mostres de control i PD, confirmant els forts canvis específics de l'AD a tot el proteoma.
A continuació, vam utilitzar un algorisme anomenat Anàlisi de xarxa de coexpressió gènica ponderada (WGCNA) per realitzar anàlisis de xarxa sobre el proteoma cerebral descobert, que organitza el conjunt de dades en mòduls de proteïnes amb patrons d'expressió similars (11-13). L'anàlisi va identificar 44 mòduls (M) de proteïnes coexpressades, ordenades i numerades des de les més grans (M1, n = 1821 proteïnes) fins a les més petites (M44, n = 34 proteïnes) (figura 2A i taula S2D). Com s'ha esmentat anteriorment (13) Calculeu el perfil d'expressió representatiu o la proteïna característica de cada mòdul i correlacioneu-lo amb l'estat de la malaltia i la patologia de la MA, és a dir, establiu l'aliança del Registre de la malaltia d'Alzheimer (CERAD) i la puntuació de Braak (Figura 2B). En total, 17 mòduls estaven relacionats significativament amb la neuropatologia de l'AD (P <0, 05). Molts d'aquests mòduls relacionats amb la malaltia també són rics en marcadors específics del tipus cel·lular (figura 2B). Com s'ha esmentat anteriorment (13), l'enriquiment del tipus cel·lular es determina mitjançant l'anàlisi de la superposició del mòdul i la llista de referència de gens específics del tipus cel·lular. Aquests gens es deriven de dades publicades en neurones de ratolí aïllades, cèl·lules endotelials i glials. Experiment de seqüenciació d'ARN (ARN-seq) (29).
(A) Descobriu el WGCNA del proteoma cerebral. (B) Anàlisi de correlació mitjana bipes (BiCor) de la proteïna de signatura modular (el primer component important de l'expressió de proteïnes modulars) amb característiques neuropatològiques de l'AD (a dalt), incloses les puntuacions CERAD (placa Aβ) i Braak (taungles). Les intensitats de les correlacions positives (vermell) i negatives (blau) es mostren mitjançant un mapa de calor de dos colors, i els asteriscs indiquen significació estadística (P <0, 05). Utilitzeu Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (a baix) per avaluar l'associació de tipus cel·lular de cada mòdul de proteïnes. La intensitat de l'ombrejat vermell indica el grau d'enriquiment del tipus cel·lular i l'asterisc indica significació estadística (P <0, 05). Utilitzeu el mètode BH per corregir el valor P derivat del FET. (C) Anàlisi GO de proteïnes modulars. Els processos biològics més relacionats es mostren per a cada mòdul o grup de mòduls relacionats. oligo, oligodendròcit.
Un conjunt de cinc mòduls rics en astròcits i microglia estretament relacionats (M30, M29, M18, M24 i M5) van mostrar una forta correlació positiva amb la neuropatologia de l'AD (figura 2B). L'anàlisi d'ontologia vincula aquests mòduls glials amb el creixement cel·lular, la proliferació i la immunitat (figura 2C i taula S2E). Dos mòduls glials addicionals, M8 i M22, també estan fortament regulats en la malaltia. M8 està molt relacionat amb la via del receptor Toll-like, una cascada de senyalització que té un paper clau en la resposta immune innata (30). Al mateix temps, M22 està estretament relacionat amb la modificació post-traduccional. M2, que és ric en oligodendròcits, mostra una forta correlació positiva amb la patologia de l'AD i una connexió ontològica amb la síntesi de nucleòsids i la replicació de l'ADN, cosa que indica una proliferació cel·lular millorada en malalties. En general, aquestes troballes donen suport a l'elevació dels mòduls glials que hem observat anteriorment al proteoma de la xarxa AD (13, 17). Actualment es troba que molts mòduls glials relacionats amb l'AD de la xarxa mostren nivells d'expressió més baixos en casos de control i PD, posant de manifest la seva especificitat de malaltia que està elevada a l'AD (figura S2C).
Només quatre mòduls del nostre proteoma de xarxa (M1, M3, M10 i M32) estan fortament correlacionats negativament amb la patologia de l'AD (P <0, 05) (Figura 2, B i C). Tant M1 com M3 són rics en marcadors neuronals. M1 està molt relacionat amb els senyals sinàptics, mentre que M3 està estretament relacionat amb la funció mitocondrial. No hi ha proves d'enriquiment del tipus cel·lular per a M10 i M32. M32 reflecteix la connexió entre M3 i el metabolisme cel·lular, mentre que M10 està molt relacionada amb el creixement cel·lular i la funció dels microtúbuls. En comparació amb l'AD, els quatre mòduls augmenten en control i PD, donant-los canvis específics de la malaltia (figura S2C). En general, aquests resultats donen suport a la disminució de l'abundància de mòduls rics en neurones que hem observat anteriorment a AD (13, 17). En resum, l'anàlisi de xarxa del proteoma cerebral que vam descobrir va produir mòduls alterats específicament per l'AD d'acord amb les nostres troballes anteriors.
La MA es caracteritza per una etapa asimptomàtica primerenca (AsymAD), en la qual els individus presenten acumulació d'amiloide sense deteriorament cognitiu clínic (5, 31). Aquesta etapa asimptomàtica representa una finestra crítica per a la detecció i intervenció precoç. Anteriorment hem demostrat una forta preservació modular del proteoma de la xarxa cerebral AsymAD i AD a través de conjunts de dades independents (13, 17). Per tal de garantir que la xarxa cerebral que hem descobert actualment és coherent amb aquestes troballes anteriors, hem analitzat la preservació de 44 mòduls en el conjunt de dades replicades de 27 organitzacions DLPFC. Aquestes organitzacions inclouen casos de control (n = 10), AsymAD (n = 8) i AD (n = 9). Les mostres de control i AD es van incloure a l'anàlisi de la nostra cohort cerebral de descobriment (taula S1B), mentre que els casos d'AsymAD només eren únics a la cohort de replicació. Aquests casos d'AsymAD també provenien del banc de cervells ADRC Emory Goizueta. Tot i que la cognició era normal en el moment de la mort, els nivells d'amiloide eren anormalment alts (mitjana de CERAD, 2, 8 ± 0, 5) (taula S1B).
L'anàlisi TMT-MS d'aquests 27 teixits cerebrals va donar lloc a la quantificació d'11.244 proteomes. Aquest recompte final inclou només aquelles proteïnes quantificades en almenys el 50% de les mostres. Aquest conjunt de dades replicat conté 8638 (98,0%) de les 8817 proteïnes detectades en la nostra anàlisi cerebral de descobriment i té prop de 3000 proteïnes canviades significativament entre les cohorts de control i AD (P <0,05, després de la prova t aparellada de Tukey per a l'anàlisi de la variància) ( Taula S2F). Entre aquestes proteïnes expressades de manera diferent, 910 també va mostrar canvis de nivell significatius entre els casos de control de l'AD i el proteoma cerebral (P <0, 05, després de la prova t aparellada ANOVA Tukey). Val la pena assenyalar que aquests 910 marcadors són molt consistents en la direcció del canvi entre proteomes (r = 0, 94, P <1, 0 × 10-200) (Figura S3A). Entre les proteïnes augmentades, les proteïnes amb els canvis més consistents entre conjunts de dades són principalment membres dels mòduls M5 i M18 rics en glials (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 i GFAP). Entre les proteïnes reduïdes, les que tenien els canvis més consistents eren gairebé exclusivament membres del mòdul M1 (NPTX2, VGF i RPH3A) associat a la sinapsi. A més, vam verificar els canvis relacionats amb l'AD de midkine (MDK), CD44, secretada proteïna 1 relacionada amb frizzled (SFRP1) i VGF mitjançant western blotting (figura S3B). L'anàlisi de preservació de mòduls va mostrar que al voltant del 80% dels mòduls de proteïnes (34/44) del proteoma cerebral es van conservar significativament en el conjunt de dades de replicació (puntuació z> 1, 96, P corregit per FDR <0, 05) (figura S3C). Catorze d'aquests mòduls es van reservar especialment entre els dos proteomes (puntuació z> 10, P corregit per FDR <1, 0 × 10−23). En general, el descobriment i la replicació de l'alt grau de consistència en l'expressió diferencial i la composició modular entre el proteoma cerebral posa de manifest la reproductibilitat dels canvis en les proteïnes de l'escorça frontal de l'AD. A més, també va confirmar que l'AsymAD i les malalties més avançades tenen una estructura de xarxa cerebral molt similar.
Una anàlisi més detallada de l'expressió diferencial en el conjunt de dades de replicació cerebral posa de manifest el grau significatiu de canvis de proteïnes AsymAD, incloent un total de 151 proteïnes canviades significativament entre AsymAD i el control (P <0, 05) (Figura S3D). D'acord amb la càrrega d'amiloide, l'APP al cervell d'AsymAD i AD va augmentar significativament. MAPT només canvia significativament en l'AD, cosa que és coherent amb l'augment dels nivells d'embolics i la seva correlació coneguda amb el declivi cognitiu (5, 7). Els mòduls rics en glials (M5 i M18) es reflecteixen molt en l'augment de proteïnes a AsymAD, mentre que el mòdul M1 relacionat amb neurones és el més representatiu de les proteïnes disminuïdes a AsymAD. Molts d'aquests marcadors AsymAD mostren majors canvis en les malalties simptomàtiques. Entre aquests marcadors hi ha SMOC1, una proteïna glial pertanyent a M18, que s'associa amb tumors cerebrals i el desenvolupament d'ulls i extremitats (32). MDK és un factor de creixement que s'uneix a l'heparina relacionat amb el creixement cel·lular i l'angiogènesi (33), un altre membre de M18. En comparació amb el grup control, AsymAD va augmentar significativament, seguit d'un major augment de l'AD. En canvi, la proteïna sinàptica neuropentraxina 2 (NPTX2) es va reduir significativament al cervell AsymAD. NPTX2 es va associar prèviament amb la neurodegeneració i té un paper reconegut en la mediació de sinapsis excitatòries (34). En general, aquests resultats revelen una varietat de canvis de proteïnes preclíniques diferents en l'AD que semblen progressar amb la gravetat de la malaltia.
Atès que hem assolit una profunditat significativa de cobertura de proteïnes en el descobriment del proteoma cerebral, estem intentant entendre més completament la seva superposició amb el transcriptoma AD a nivell de xarxa. Per tant, vam comparar el proteoma cerebral que vam descobrir amb el mòdul que vam generar prèviament a partir de la mesura de microarrays de 18.204 gens en teixits DLPFC d'AD (n = 308) i control (n = 157) (13). superposant-se. En total, vam identificar 20 mòduls d'ARN diferents, molts dels quals van demostrar l'enriquiment de tipus cel·lulars específics, incloses les neurones, els oligodendròcits, els astròcits i la micròglia (figura 3A). Els múltiples canvis d'aquests mòduls a AD es mostren a la figura 3B. D'acord amb la nostra anàlisi anterior de superposició proteïna-ARN utilitzant el proteoma MS més profund sense etiquetar (unes 3000 proteïnes) (13), la majoria dels 44 mòduls de la xarxa de proteoma cerebral que hem trobat es troben a la xarxa de transcriptoma. No hi ha cap solapament significatiu. el nostre descobriment i replicació dels 34 mòduls de proteïnes que es mantenen altament al proteoma cerebral, només 14 (~ 40%) van passar la prova exacta de Fisher (FET) van demostrar tenir una superposició estadísticament significativa amb el transcriptoma (figura 3A). Compatible amb reparació de danys a l'ADN (P-M25 i P-M19), traducció de proteïnes (P-M7 i P-M20), unió/splicing d'ARN (P-M16 i P-M21) i orientació a proteïnes (P-M13 i P-). M23) no es solapa amb els mòduls del transcriptoma. Per tant, tot i que s'utilitza un conjunt de dades de proteoma més profund en l'anàlisi de superposició actual (13), la major part del proteoma de la xarxa AD no està assignat a la xarxa de transcriptoma.
(A) El FET hipergeomètric demostra l'enriquiment dels marcadors específics del tipus cel·lular al mòdul d'ARN del transcriptoma AD (a dalt) i el grau de superposició entre els mòduls d'ARN (eix x) i proteïnes (eix y) del cervell AD. (a baix). La intensitat de l'ombrejat vermell indica el grau d'enriquiment dels tipus de cèl·lules al panell superior i la intensitat de la superposició dels mòduls al panell inferior. Els asteriscs indiquen significació estadística (P <0,05). (B) El grau de correlació entre els gens característics de cada mòdul de transcriptoma i l'estat d'AD. Els mòduls de l'esquerra són els més negativament correlacionats amb AD (blau), i els de la dreta són els més positivament correlacionats amb AD (vermell). El valor P corregit per BH transformat en logaritme indica el grau de significació estadística de cada correlació. (C) Mòduls superposats significatius amb enriquiment de tipus cel·lular compartit. (D) Anàlisi de correlació del canvi de vegades logarítmica 2 de la proteïna etiquetada (eix x) i l'ARN (eix y) al mòdul superposat. Es mostra el coeficient de correlació de Pearson amb el valor P rellevant. Micro, microglia; cossos celestes, astròcits. TC, control.
La majoria dels mòduls de proteïnes i ARN superposats comparteixen perfils d'enriquiment de tipus cel·lular similars i direccions de canvi d'AD consistents (figura 3, B i C). En altres paraules, el mòdul M1 relacionat amb la sinapsi del proteoma cerebral (PM1) està mapejat a tres mòduls d'ARN homòleg rics en neurones (R-M1, R-M9 i R-M16), que es troben a AD. Tots dos van mostrar un nivell reduït. De la mateixa manera, els mòduls de proteïnes M5 i M18 rics en glials se superposen amb mòduls d'ARN rics en astròcits i marcadors microglials (R-M3, R-M7 i R-M10) i estan molt implicats en les malalties. Aquestes característiques modulars compartides entre els dos conjunts de dades donen suport encara més a l'enriquiment del tipus cel·lular i als canvis relacionats amb la malaltia que hem observat al proteoma cerebral. Tanmateix, vam observar moltes diferències significatives entre els nivells d'ARN i proteïnes dels marcadors individuals en aquests mòduls compartits. L'anàlisi de correlació de l'expressió diferencial de la proteòmica i la transcriptòmica de les molècules dins d'aquests mòduls superposats (figura 3D) posa de manifest aquesta inconsistència. Per exemple, APP i diverses altres proteïnes del mòdul glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 i SFRP1) van mostrar un augment significatiu del proteoma AD, però gairebé no hi va haver cap canvi en el transcriptoma AD. Aquests canvis específics de proteïnes poden estar estretament relacionats amb les plaques amiloides (23, 35), destacant el proteoma com a font de canvis patològics, i aquests canvis poden no reflectir-se en el transcriptoma.
Després d'analitzar de manera independent els proteomes del cervell i del LCR que vam descobrir, vam realitzar una anàlisi exhaustiva dels dos conjunts de dades per identificar biomarcadors AD CSF relacionats amb la fisiopatologia de la xarxa cerebral. Primer hem de definir la superposició dels dos proteomes. Tot i que està àmpliament acceptat que el LCR reflecteix canvis neuroquímics al cervell de l'AD (4), el grau exacte de superposició entre el cervell de l'AD i el proteoma del LCR no està clar. En comparar el nombre de productes gènics compartits detectats als nostres dos proteomes, vam trobar que gairebé el 70% (n = 1936) de les proteïnes identificades al líquid cefaloraquidi també es van quantificar al cervell (figura 4A). La majoria d'aquestes proteïnes superposades (n = 1721) es mapegen a un dels 44 mòduls de coexpressió del conjunt de dades del cervell de descobriment (figura 4B). Com era d'esperar, els sis mòduls cerebrals més grans (M1 a M6) van mostrar la major quantitat de superposició de CSF. Tanmateix, hi ha mòduls cerebrals més petits (per exemple, M15 i M29) que aconsegueixen un grau de superposició inesperadament alt, més gran que un mòdul cerebral el doble de la seva mida. Això ens motiva a adoptar un mètode més detallat i dirigit estadísticament per calcular la superposició entre el cervell i el líquid cefaloraquidi.
(A i B) Les proteïnes detectades als conjunts de dades del cervell de descobriment i CSF se superposen. La majoria d'aquestes proteïnes superposades estan associades amb un dels 44 mòduls de coexpressió de la xarxa de coexpressió cerebral. (C) Descobriu la superposició entre el proteoma del líquid cefaloraquidi i el proteoma de la xarxa cerebral. Cada fila del mapa de calor representa una anàlisi de solapament independent del FET hipergeomètric. La fila superior representa la superposició (ombrejat gris/negre) entre el mòdul cerebral i tot el proteoma CSF. La segona línia mostra que la superposició entre els mòduls cerebrals i la proteïna CSF (ombrejat en vermell) està significativament regulada a l'AD (P <0, 05). La tercera fila mostra que la superposició entre els mòduls cerebrals i la proteïna CSF (ombrejat blau) està significativament regulada a la baixa en AD (P <0, 05). Utilitzeu el mètode BH per corregir el valor P derivat del FET. (D) Tauler de mòdul plegable basat en l'associació de tipus cel·lular i els termes GO relacionats. Aquests panells contenen un total de 271 proteïnes relacionades amb el cervell, que tenen una expressió diferencial significativa al proteoma CSF.
Utilitzant FET d'una sola cua, es va avaluar la importància de la superposició de proteïnes entre el proteoma CSF i els mòduls cerebrals individuals. L'anàlisi va revelar que un total de 14 mòduls cerebrals del conjunt de dades del CSF tenen solapaments estadísticament significatius (FDR ajustat P <0, 05) i un mòdul addicional (M18) el solapament del qual és proper a la significació (FDR ajustat P = 0, 06) (Figura 4C). , fila superior). També estem interessats en mòduls que se superposen fortament amb proteïnes CSF expressades de manera diferent. Per tant, vam aplicar dues anàlisis FET addicionals per determinar quina de (i) la proteïna CSF va augmentar significativament en l'AD i (ii) la proteïna CSF va disminuir significativament en l'AD (P <0, 05, prova t aparellada AD/control) Mòduls cerebrals amb una superposició significativa entre ells. Tal com es mostra a les files mitjanes i inferiors de la figura 4C, aquestes anàlisis addicionals mostren que 8 dels 44 mòduls cerebrals es superposen significativament amb la proteïna afegida a l'AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 i M38) . ), mentre que només dos mòduls (M6 i M15) van mostrar una superposició significativa amb la proteïna reduïda en AD CSF. Com era d'esperar, els 10 mòduls es troben en els 15 mòduls amb la superposició més alta amb el proteoma CSF. Per tant, suposem que aquests 15 mòduls són fonts d'alt rendiment de biomarcadors de LCR derivats del cervell d'AD.
Hem plegat aquests 15 mòduls superposats en cinc grans panells de proteïnes en funció de la seva proximitat al diagrama d'arbre WGCNA i la seva associació amb els tipus de cèl·lules i l'ontologia gènica (figura 4D). El primer panell conté mòduls rics en marcadors neuronals i proteïnes relacionades amb la sinapsis (M1 i M12). El panell sinàptic conté un total de 94 proteïnes i els nivells del proteoma LCR han canviat significativament, convertint-lo en la font més gran de marcadors de LCR relacionats amb el cervell entre els cinc panells. El segon grup (M6 i M15) va demostrar l'estreta connexió amb els marcadors de cèl·lules endotelials i el cos vascular, com ara la "curació de ferides" (M6) i la "regulació de la resposta immune humoral" (M15). M15 també està molt relacionat amb el metabolisme de les lipoproteïnes, que està estretament relacionat amb l'endoteli (36). El panell vascular conté 34 marcadors de LCR relacionats amb el cervell. El tercer grup inclou mòduls (M2 i M4) que estan significativament relacionats amb els marcadors d'oligodendròcits i la proliferació cel·lular. Per exemple, els termes d'ontologia de primer nivell de M2 inclouen "regulació positiva de la replicació de l'ADN" i "procés de biosíntesi de purines". Mentrestant, els de M4 inclouen "diferenciació de cèl·lules glials" i "segregació de cromosomes". El panell de mielinització conté 49 marcadors de LCR relacionats amb el cervell.
El quart grup conté la majoria de mòduls (M30, M29, M18, M24 i M5) i gairebé tots els mòduls són significativament rics en marcadors de microglia i astròcits. De manera similar al panell de mielinització, el quart panell també conté mòduls (M30, M29 i M18) que estan estretament relacionats amb la proliferació cel·lular. La resta de mòduls d'aquest grup estan molt relacionats amb termes immunològics, com ara "procés d'efecte immune" (M5) i "regulació de la resposta immune" (M24). El grup immunitari glial conté 42 marcadors de LCR relacionats amb el cervell. Finalment, l'últim panell inclou 52 marcadors relacionats amb el cervell als quatre mòduls (M44, M3, M33 i M38), tots ells relacionats amb l'emmagatzematge d'energia i el metabolisme del cos. El més gran d'aquests mòduls (M3) està estretament relacionat amb els mitocondris i és ric en marcadors específics de neurones. M38 és un dels membres del mòdul més petits d'aquest metaboloma i també presenta una especificitat neuronal moderada.
En general, aquests cinc panells reflecteixen una àmplia gamma de tipus i funcions cel·lulars a l'escorça de l'AD i contenen col·lectivament 271 marcadors de LCR relacionats amb el cervell (taula S2G). Per avaluar la validesa d'aquests resultats de MS, vam utilitzar l'assaig d'extensió de proximitat (PEA), una tecnologia basada en anticossos ortogonals amb capacitats de multiplexació, alta sensibilitat i especificitat, i vam reanalitzar les mostres de líquid cefaloraquidi que vam trobar Un subconjunt d'aquests 271 biomarcadors. (n = 36). Aquests 36 objectius demostren el canvi en el múltiple AD de PEA, que està estretament relacionat amb les nostres troballes basades en MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), que va verificar amb força els resultats de la nostra anàlisi completa de MS (figura S4). ).
Els temes biològics emfatitzats pels nostres cinc grups, des de la senyalització sinàptica fins al metabolisme energètic, estan tots relacionats amb la patogènesi de l'AD (1-3). Per tant, els 15 mòduls que contenen aquests panells estan relacionats amb la patologia de l'AD al proteoma cerebral que vam descobrir (figura 2B). El més notable és l'alta correlació patològica positiva entre els nostres mòduls glials i la forta correlació patològica negativa entre els nostres mòduls neuronals més grans (M1 i M3). L'anàlisi d'expressió diferencial del nostre proteoma cerebral replicat (figura S3D) també destaca les proteïnes glials derivades de M5 i M18. En l'AsymAD i la MA simptomàtica, les proteïnes glials més augmentades i les sinapsis relacionades amb M1 La proteïna es redueix més. Aquestes observacions indiquen que els 271 marcadors de líquid cefaloraquidi que vam identificar als cinc grups estan relacionats amb processos de malaltia a l'escorça de la MA, inclosos els que es produeixen en les primeres etapes asimptomàtiques.
Per analitzar millor la direcció del canvi de les proteïnes del panell al cervell i al líquid cefaloraquidi, vam dibuixar el següent per a cadascun dels 15 mòduls superposats: (i) vam trobar el nivell d'abundància del mòdul al conjunt de dades del cervell i (ii) el mòdul. proteïna La diferència s'expressa en el líquid cefaloraquidi (figura S5). Com s'ha esmentat anteriorment, WGCNA s'utilitza per determinar l'abundància del mòdul o el valor de proteïna característic al cervell (13). El mapa volcànic s'utilitza per descriure l'expressió diferencial de proteïnes modulars al líquid cefaloraquidi (AD/control). Aquestes xifres mostren que tres dels cinc panells mostren tendències d'expressió diferents al cervell i al líquid cefaloraquidi. Els dos mòduls del panell de sinapsi (M1 i M12) mostren una disminució del nivell d'abundància al cervell de l'AD, però es superposen significativament amb l'augment de proteïna del CSF de l'AD (figura S5A). Els mòduls relacionats amb les neurones que contenien el metaboloma (M3 i M38) mostraven patrons d'expressió similars al cervell i al líquid cefaloraquidi inconsistents (figura S5E). El panell vascular també va mostrar diferents tendències d'expressió, tot i que els seus mòduls (M6 i M15) van augmentar moderadament al cervell AD i van disminuir al LCR malalt (figura S5B). Els dos panells restants contenen grans xarxes glials les proteïnes de les quals estan constantment regulades en ambdós compartiments (figura S5, C i D).
Tingueu en compte que aquestes tendències no són comunes a tots els marcadors d'aquests panells. Per exemple, el panell sinàptic inclou diverses proteïnes que es redueixen significativament al cervell AD i al LCR (figura S5A). Entre aquests marcadors de líquid cefaloraquidi regulats a la baixa hi ha NPTX2 i VGF de M1 i la cromogranina B de M12. No obstant això, malgrat aquestes excepcions, la majoria dels nostres marcadors sinàptics estan elevats al líquid cefaloraquidi de l'AD. En general, aquestes anàlisis van poder distingir tendències estadísticament significatives en els nivells de cervell i líquid cefaloraquidi en cadascun dels nostres cinc panells. Aquestes tendències posen de manifest la relació complexa i sovint diferent entre l'expressió de proteïnes del cervell i del LCR a l'AD.
A continuació, vam utilitzar l'anàlisi de replicació de MS d'alt rendiment (replicació CSF 1) per reduir el nostre conjunt de 271 biomarcadors als objectius més prometedors i reproduïbles (figura 5A). La còpia 1 de CSF conté un total de 96 mostres de Emory Goizueta ADRC, incloent control, AsymAD i cohort AD (taula S1A). Aquests casos d'AD es caracteritzen per un declivi cognitiu lleu (MoCA mitjà, 20,0 ± 3,8) i canvis en els biomarcadors d'AD confirmats en el líquid cefaloraquidi (taula S1A). Contràriament a l'anàlisi de LCR que hem trobat, aquesta replicació es realitza mitjançant un mètode MS "d'un sol tir" més eficient i d'alt rendiment (sense fraccionament fora de línia), inclòs un protocol simplificat de preparació de mostres que elimina la necessitat d'immunodepleció de mostres individuals. . En lloc d'això, s'utilitza un únic "canal de millora" immune esgotat per amplificar el senyal de proteïnes menys abundants (37). Tot i que redueix la cobertura total del proteoma, aquest mètode d'un sol tir redueix significativament el temps de la màquina i augmenta el nombre de mostres marcades amb TMT que es poden analitzar viables (17, 38). En total, l'anàlisi va identificar 6.487 pèptids, que es van mapar a 1.183 proteomes en 96 casos. Igual que amb l'anàlisi de LCR que vam trobar, només es van incloure en els càlculs posteriors aquelles proteïnes quantificades en almenys el 50% de les mostres, i les dades es van retrocedir per als efectes de l'edat i el gènere. Això va conduir a la quantificació final de 792 proteomes, el 95% dels quals també es van identificar al conjunt de dades de LCR trobat.
(A) Objectius de proteïna de LCR relacionats amb el cervell verificats a la primera cohort de LCR replicat i inclosos al panell final (n = 60). (B a E) Nivells de biomarcadors del panell (puntuació z composta) mesurats a les quatre cohorts de replicació del LCR. Es van utilitzar proves t aparellades o ANOVA amb la correcció posterior de Tukey per avaluar la significació estadística dels canvis d'abundància en cada anàlisi replicada. TC, control.
Com que estem especialment interessats a verificar els nostres 271 objectius de LCR relacionats amb el cervell mitjançant una anàlisi exhaustiva, limitarem l'examen posterior d'aquest proteoma replicat a aquests marcadors. Entre aquestes 271 proteïnes, se'n van detectar 100 en la replicació 1 del LCR. La figura S6A mostra l'expressió diferencial d'aquests 100 marcadors superposats entre les mostres de control i de replicació d'AD. Les histones sinàptiques i metabòliques augmenten més en la MA, mentre que les proteïnes vasculars disminueixen més en la malaltia. La majoria dels 100 marcadors superposats (n = 70) van mantenir la mateixa direcció de canvi en els dos conjunts de dades (figura S6B). Aquests 70 marcadors validats de CSF relacionats amb el cervell (taula S2H) reflecteixen en gran mesura les tendències d'expressió del panell observades anteriorment, és a dir, la regulació a la baixa de les proteïnes vasculars i la regulació positiva de tots els altres panells. Només 10 d'aquestes 70 proteïnes validades van mostrar canvis en l'abundància d'AD que van contradir aquestes tendències del panell. Per tal de generar un panell que reflecteixi millor la tendència general del cervell i el líquid cefaloraquidi, vam excloure aquestes 10 proteïnes del panell d'interès que finalment vam verificar (figura 5A). Per tant, el nostre panell inclou finalment un total de 60 proteïnes verificades en dues cohorts independents de CSF AD mitjançant diferents preparacions de mostres i anàlisi de plataforma MS. Les trames d'expressió de puntuació z d'aquests panells finals al control CSF còpia 1 i casos d'AD van confirmar la tendència del panell observada a la cohort CSF que vam trobar (figura 5B).
Entre aquestes 60 proteïnes, hi ha molècules conegudes per estar associades a l'AD, com l'osteopontina (SPP1), que és una citocina proinflamatòria que s'ha associat amb l'AD en molts estudis (39-41), i GAP43, una proteïna sinàptica A. que està clarament relacionat amb la neurodegeneració (42). Les proteïnes més verificades són marcadors relacionats amb altres malalties neurodegeneratives, com ara la superòxid dismutasa 1 (SOD1) relacionada amb l'esclerosi lateral amiotròfica (ELA) i la desacarasa relacionada amb la malaltia de Parkinson (PARK7). També hem verificat que molts altres marcadors, com SMOC1 i la proteïna 1 de senyalització d'adhesió a la membrana rica en cervell (BASP1), tenen enllaços anteriors limitats a la neurodegeneració. Val la pena assenyalar que a causa de la seva baixa abundància global al proteoma CSF, ens és difícil utilitzar aquest mètode de detecció d'un sol tir d'alt rendiment per detectar de manera fiable MAPT i algunes altres proteïnes relacionades amb l'AD (per exemple, NEFL i NRGN). ) ( 43, 44).
A continuació, vam comprovar aquests 60 marcadors de panell de prioritat en tres anàlisis repetides addicionals. A CSF Copy 2, vam utilitzar un únic TMT-MS per analitzar una cohort independent de 297 mostres de control i AD de Emory Goizueta ADRC (17). La replicació del LCR 3 va incloure una reanàlisi de les dades de TMT-MS disponibles de 120 pacients control i AD de Lausana, Suïssa (45). Hem detectat més de dos terços dels 60 marcadors de prioritat de cada conjunt de dades. Tot i que l'estudi suís va utilitzar diferents plataformes de MS i mètodes de quantificació de TMT (45, 46), vam reproduir fortament les tendències del nostre panell en dues anàlisis repetides (figura 5, C i D i taules S2, I i J). Per avaluar l'especificitat de la malaltia del nostre grup, vam utilitzar TMT-MS per analitzar el quart conjunt de dades de replicació (replicació CSF 4), que incloïa no només casos de control (n = 18) i AD (n = 17), sinó també PD ( n = 14)), ALS (n = 18) i mostres de demència frontotemporal (FTD) (n = 11) (taula S1A). Hem quantificat amb èxit gairebé dos terços de les proteïnes del panell d'aquesta cohort (38 de 60). Aquests resultats posen de manifest els canvis específics de l'AD als cinc panells de biomarcadors (figura 5E i taula S2K). L'augment del grup de metabòlits va mostrar l'especificitat d'AD més forta, seguit del grup de mielinització i glial. En menor mesura, FTD també mostra un augment entre aquests panells, que pot reflectir canvis potencials similars a la xarxa (17). En canvi, l'ELA i la PD van mostrar gairebé els mateixos perfils de mielinització, glial i metaboloma que el grup control. En general, malgrat les diferències en la preparació de mostres, la plataforma MS i els mètodes de quantificació de TMT, aquestes anàlisis repetides mostren que els nostres marcadors de panell prioritaris tenen canvis específics d'AD molt consistents en més de 500 mostres úniques de CSF.
La neurodegeneració de l'AD ha estat àmpliament reconeguda diversos anys abans de l'aparició dels símptomes cognitius, per la qual cosa hi ha una necessitat urgent de biomarcadors d'AsymAD (5, 31). Tanmateix, cada cop hi ha més evidències que mostren que la biologia d'AsymAD està lluny de ser homogènia, i la complexa interacció del risc i la resiliència condueix a grans diferències individuals en la progressió posterior de la malaltia (47). Encara que s'utilitzen per identificar casos d'AsymAD, els nivells de biomarcadors bàsics de LCR (Aβ1-42, tau total i p-tau) no han demostrat ser capaços de predir de manera fiable qui progressarà cap a la demència (4, 7), cosa que indica més. És necessari incloure eines de biomarcadors holístics basades en múltiples aspectes de la fisiologia cerebral per estratificar amb precisió el risc d'aquesta població. Per tant, posteriorment vam analitzar el nostre panell de biomarcadors validats per AD a la població d'AsymAD de la còpia 1 de LCR. Aquests 31 casos d'AsymAD van mostrar nivells de biomarcadors bàsics anormals (proporció ELISA Aβ1-42/tau total, <5,5) i cognició completa (MoCA mitjana, 27,1). ± 2,2) (Taula S1A). A més, tots els individus amb AsymAD tenen una puntuació de demència clínica de 0, cosa que indica que no hi ha evidència d'una disminució del rendiment cognitiu o funcional diari.
Primer vam analitzar els nivells dels panells validats en les 96 rèpliques de CSF 1, inclosa la cohort AsymAD. Vam trobar que diversos panells del grup AsymAD tenien canvis significatius d'abundància semblants a l'AD, el panell vascular va mostrar una tendència a la baixa en AsymAD, mentre que tots els altres panells van mostrar una tendència a l'alça (figura 6A). Per tant, tots els panells van mostrar una correlació molt significativa amb ELISA Aβ1-42 i els nivells totals de tau (figura 6B). En canvi, la correlació entre el grup i la puntuació MoCA és relativament pobra. Una de les troballes més sorprenents d'aquestes anàlisis és la gran varietat d'abundància de panells a la cohort AsymAD. Com es mostra a la figura 6A, el nivell del panell del grup AsymAD sol creuar el nivell del panell del grup de control i el grup AD, mostrant una variabilitat relativament alta. Per explorar més aquesta heterogeneïtat d'AsymAD, hem aplicat l'anàlisi d'escala multidimensional (MDS) a 96 casos de replicació 1 de CSF. L'anàlisi MDS permet visualitzar la similitud entre casos a partir de determinades variables del conjunt de dades. Per a aquesta anàlisi de clúster, només utilitzem aquells marcadors de panell validats que tenen un canvi estadísticament significatiu (P <0, 05, AD/control) en el nivell de descobriment i replicació del CSF 1 (n = 29) (Taula S2L). Aquesta anàlisi va produir una clara agrupació espacial entre els nostres casos de control i AD (figura 6C). En canvi, alguns casos d'AsymAD es troben clarament agrupats en el grup control, mentre que altres es troben en casos d'AD. Per explorar més aquesta heterogeneïtat d'AsymAD, hem utilitzat el nostre mapa MDS per definir dos grups d'aquests casos d'AsymAD. El primer grup incloïa casos d'AsymAD agrupats més a prop del control (n = 19), mentre que el segon grup es va caracteritzar per casos d'AsymAD amb un perfil de marcador més proper a l'AD (n = 12).
(A) El nivell d'expressió (puntuació z) del grup de biomarcadors de CSF a les 96 mostres de la cohort 1 de replicació de CSF, inclòs AsymAD. L'anàlisi de la variància amb la correcció posterior de Tukey es va utilitzar per avaluar la importància estadística dels canvis d'abundància del panell. (B) Anàlisi de correlació del nivell d'abundància de proteïnes del panell (puntuació z) amb la puntuació de MoCA i el nivell de tau total en mostres ELISA Aβ1-42 i CSF còpia 1. Es mostra el coeficient de correlació de Pearson amb el valor P rellevant. (C) L'MDS de 96 casos de còpia 1 de CSF es va basar en els nivells d'abundància de 29 marcadors de panell validats, que es van canviar significativament tant en el conjunt de dades de descobriment com en la còpia 1 de CSF [P <0, 05 AD/control (CT)]. Aquesta anàlisi es va utilitzar per dividir el grup AsymAD en subgrups de control (n = 19) i AD (n = 12). (D) La trama del volcà mostra l'expressió diferencial de totes les proteïnes de replicació 1 de CSF amb canvi de vegades log2 (eix x) en relació amb el valor P estadístic -log10 entre els dos subgrups AsymAD. Els biomarcadors del panell són de colors. (E) El nivell d'abundància de la replicació CSF 1 dels biomarcadors del grup de selecció s'expressen de manera diferent entre els subgrups AsymAD. L'anàlisi de la variància post-ajustada de Tukey es va utilitzar per avaluar la significació estadística.
Es va examinar l'expressió diferencial de proteïnes entre aquests casos de control i d'AsymAD similars a l'AD (figura 6D i taula S2L). El mapa de volcans resultant mostra que 14 marcadors de panells han canviat significativament entre els dos grups. La majoria d'aquests marcadors són membres de la sinapsi i el metaboloma. Tanmateix, SOD1 i el substrat de proteïna cinasa C ric en alanina miristoilada (MARCKS), que són membres dels grups immunitaris mielina i glial, respectivament, també pertanyen a aquest grup (figura 6, D i E). El panell vascular també va contribuir amb dos marcadors que es van reduir significativament al grup AsymAD similar a l'AD, inclosa la proteïna d'unió AE 1 (AEBP1) i el membre de la família del complement C9. No hi va haver cap diferència significativa entre el control i els subgrups AsymAD similars a l'AD a ELISA AB1-42 (P = 0,38) i p-tau (P = 0,28), però efectivament hi va haver una diferència significativa en el nivell total de tau (P = 0,0031). ) (Fig. S7). Hi ha diversos marcadors de panells que indiquen que els canvis entre els dos subgrups AsymAD són més significatius que els nivells totals de tau (per exemple, YWHAZ, SOD1 i MDH1) (figura 6E). En general, aquests resultats indiquen que el nostre panell validat pot contenir biomarcadors que poden subtipificar i estratificar el risc potencial de pacients amb malaltia asimptomàtica.
Hi ha una necessitat urgent d'eines de biomarcadors basades en sistemes per mesurar i orientar millor les diferents fisiopatologia que hi ha darrere de l'AD. S'espera que aquestes eines no només canviïn el nostre marc de diagnòstic d'AD, sinó que també promoguin l'adopció d'estratègies de tractament efectives i específiques del pacient (1, 2). Amb aquesta finalitat, vam aplicar un enfocament de proteòmica integral imparcial al cervell de l'AD i al LCR per identificar biomarcadors de LCR basats en web que reflecteixen una àmplia gamma de fisiopatologia basada en el cervell. La nostra anàlisi va produir cinc panells de biomarcadors de LCR, que (i) reflecteixen sinapsis, vasos sanguinis, mielina, disfunció immune i metabòlica; (ii) demostrar una forta reproductibilitat en diferents plataformes MS; (iii) Mostra canvis progressius específics de la malaltia al llarg de les etapes primerenques i tardanes de la MA. En general, aquestes troballes representen un pas prometedor cap al desenvolupament d'eines de biomarcadors diverses, fiables i orientades a la web per a la investigació de la MA i les aplicacions clíniques.
Els nostres resultats demostren l'organització altament conservada del proteoma de la xarxa cerebral AD i donen suport al seu ús com a àncora per al desenvolupament de biomarcadors basats en sistemes. La nostra anàlisi mostra que dos conjunts de dades TMT-MS independents que contenen cervells AD i AsymAD tenen una gran modularitat. Aquestes troballes amplien el nostre treball anterior, demostrant la preservació dels potents mòduls de més de 2.000 teixits cerebrals de múltiples cohorts independents a l'escorça frontal, parietal i temporal (17). Aquesta xarxa de consens reflecteix diversos canvis relacionats amb la malaltia observats en la investigació actual, inclòs l'augment de mòduls inflamatoris rics en glials i la disminució de mòduls rics en neurones. Igual que la investigació actual, aquesta xarxa a gran escala també presenta canvis modulars significatius en AsymAD, que mostren una varietat de fisiopatologia preclínica diferents (17).
Tanmateix, dins d'aquest marc basat en sistemes altament conservador, hi ha una heterogeneïtat biològica més fina, especialment entre els individus en les primeres etapes de l'AD. El nostre panell de biomarcadors és capaç de representar dos subgrups a AsymAD, que demostren l'expressió diferencial significativa de múltiples marcadors de LCR. El nostre grup va poder destacar les diferències biològiques entre aquests dos subgrups, que no eren òbvies a nivell dels biomarcadors bàsics de l'AD. En comparació amb el grup control, les proporcions Aβ1-42/tau total d'aquests individus AsymAD eren anormalment baixes. Tanmateix, només els nivells totals de tau eren significativament diferents entre els dos subgrups d'AsymAD, mentre que els nivells d'Aβ1-42 i p-tau es van mantenir relativament comparables. Com que la tau alta de LCR sembla ser un millor predictor dels símptomes cognitius que els nivells d'Aβ1-42 (7), sospitem que les dues cohorts d'AsymAD poden tenir diferents riscos de progressió de la malaltia. Donada la mida limitada de la mostra del nostre AsymAD i la manca de dades longitudinals, calen més investigacions per treure aquestes conclusions amb confiança. Tanmateix, aquests resultats indiquen que un panell de LCR basat en el sistema pot millorar la nostra capacitat d'estratificar eficaçment les persones durant l'etapa asimptomàtica de la malaltia.
En general, les nostres troballes donen suport al paper de múltiples funcions biològiques en la patogènesi de l'AD. Tanmateix, el metabolisme energètic desregulat es va convertir en el tema destacat dels nostres cinc panells d'etiquetatge validats. Les proteïnes metabòliques, com la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa 1 (HPRT1) i la lactat deshidrogenasa A (LDHA), són els biomarcadors sinàptics més validats, cosa que indica que l'augment de l'AD CSF és un sexe altament reproducible. Els nostres vasos sanguinis i panells glials també contenen diversos marcadors implicats en el metabolisme de substàncies oxidatives. Aquestes troballes són coherents amb el paper clau que tenen els processos metabòlics a tot el cervell, no només per satisfer l'alta demanda d'energia de les neurones, sinó també per satisfer l'alta demanda d'energia dels astròcits i altres cèl·lules glials (17, 48). Els nostres resultats donen suport a l'evidència creixent que els canvis en el potencial redox i la interrupció de les vies energètiques poden ser l'enllaç bàsic entre diversos processos clau implicats en la patogènesi de la MA, inclosos els trastorns mitocondrials, la inflamació mediada per la glia i el dany vascular (49). A més, els biomarcadors metabòlics del líquid cefaloraquidi contenen un gran nombre de proteïnes diferentment riques entre el nostre control i els subgrups AsymAD similars a l'AD, cosa que suggereix que la interrupció d'aquestes vies d'energia i redox pot ser crítica en l'etapa preclínica de la malaltia.
Les diferents tendències del panell de cervell i líquid cefaloraquidi que hem observat també tenen implicacions biològiques interessants. Les sinapsis i metabolomes rics en neurones mostren nivells reduïts al cervell d'AD i augment de l'abundància en el líquid cefaloraquidi. Atès que les neurones són riques en mitocondris productors d'energia a les sinapsis per proporcionar energia als seus nombrosos senyals especialitzats (50), s'espera la similitud dels perfils d'expressió d'aquests dos grups de neurones. La pèrdua de neurones i l'extrusió de cèl·lules danyades poden explicar aquestes tendències del panell del cervell i del LCR en malalties posteriors, però no poden explicar els canvis primerencs del panell que observem (13). Una possible explicació d'aquestes troballes en la malaltia asimptomàtica primerenca és la poda sinàptica anormal. Les noves evidències en models de ratolí suggereixen que la fagocitosi sinàptica mediada per la microglia es pot activar de manera anormal en l'AD i conduir a la pèrdua precoç de la sinapsi al cervell (51). Aquest material sinàptic descartat pot acumular-se al LCR, per això observem l'augment del LCR al panell de neurones. La poda sinàptica mediada per la immunitat també pot explicar parcialment l'augment de proteïnes glials que observem al cervell i al líquid cefaloraquidi al llarg del procés de la malaltia. A més de la poda sinàptica, les anomalies generals de la via exocítica també poden provocar diferents expressions cerebrals i de LCR dels marcadors neuronals. Diversos estudis han demostrat que el contingut dels exosomes en la patogènesi del cervell de l'AD ha canviat (52). La via extracel·lular també està implicada en la proliferació d'Aβ (53, 54). Val la pena assenyalar que la supressió de la secreció exosomal pot reduir la patologia semblant a l'AD en models de ratolins transgènics d'AD (55).
Al mateix temps, la proteïna del panell vascular va mostrar un augment moderat del cervell d'AD, però va disminuir significativament en el LCR. La disfunció de la barrera hematoencefàlica (BBB) pot explicar en part aquestes troballes. Molts estudis en humans postmortem independents han demostrat la ruptura del BBB a l'AD (56, 57). Aquests estudis van confirmar diverses activitats anormals al voltant d'aquesta capa tancada de cèl·lules endotelials, incloses les fuites capil·lars cerebrals i l'acumulació perivascular de proteïnes transmeses per la sang (57). Això pot proporcionar una explicació senzilla per a les proteïnes vasculars elevades al cervell, però no pot explicar completament l'esgotament d'aquestes mateixes proteïnes al líquid cefaloraquidi. Una possibilitat és que el sistema nerviós central estigui aïllant activament aquestes molècules per resoldre el problema de l'augment de la inflamació i l'estrès oxidatiu. La reducció d'algunes de les proteïnes de LCR més greus d'aquest panell, especialment les implicades en la regulació de les lipoproteïnes, està relacionada amb la inhibició de nivells nocius d'inflamació i el procés neuroprotector de les espècies reactives d'oxigen. Això és cert per a la paroxonasa 1 (PON1), un enzim d'unió a lipoproteïnes responsable de reduir els nivells d'estrès oxidatiu a la circulació (58, 59). El precursor de l'alfa-1-microglobulina/bikunina (AMBP) és un altre marcador significativament regulat a la baixa del grup vascular. És el precursor del transportador de lípids bikunina, que també participa en la supressió de la inflamació i la protecció neurològica (60, 61).
Malgrat diverses hipòtesis interessants, la incapacitat de detectar directament els mecanismes de malalties bioquímiques és una limitació coneguda de l'anàlisi proteòmica impulsada pel descobriment. Per tant, calen més investigacions per definir amb confiança els mecanismes darrere d'aquests panells de biomarcadors. Per avançar cap al desenvolupament d'anàlisis clíniques basades en MS, la direcció futura també requereix l'ús de mètodes quantitatius dirigits per a la verificació de biomarcadors a gran escala, com ara el seguiment selectiu o paral·lel de reaccions (62). Recentment hem utilitzat el monitoratge de reaccions paral·leles (63) per validar molts dels canvis de proteïnes del LCR descrits aquí. Diversos objectius del panell prioritaris es quantifiquen amb una precisió significativa, inclosos YWHAZ, ALDOA i SMOC1, que mapegen als nostres panells de sinapsi, metabolisme i inflamació, respectivament (63). L'adquisició de dades independent (DIA) i altres estratègies basades en MS també poden ser útils per a la verificació d'objectius. Bud et al. (64) Recentment s'ha demostrat que hi ha una superposició significativa entre els biomarcadors AD identificats al nostre conjunt de dades de descobriment de CSF i el conjunt de dades independent DIA-MS, que consta de prop de 200 mostres de CSF de tres cohorts europees diferents. Aquests estudis recents donen suport al potencial dels nostres panells per transformar-se en una detecció fiable basada en MS. La detecció tradicional d'anticossos i aptàmers també és important per al desenvolupament de biomarcadors clau d'AD. A causa de la baixa abundància de LCR, és més difícil detectar aquests biomarcadors mitjançant mètodes de MS d'alt rendiment. NEFL i NRGN són dos exemples de biomarcadors de CSF de baixa abundància, que es mapegen al panell en la nostra anàlisi exhaustiva, però que no es poden detectar de manera fiable mitjançant la nostra estratègia única de MS. Les estratègies d'orientació basades en múltiples anticossos, com el PEA, poden promoure la transformació clínica d'aquests marcadors.
En general, aquest estudi proporciona un enfocament proteòmic únic per a la identificació i verificació de biomarcadors de LCR AD basat en diferents sistemes. L'optimització d'aquests panells de marcadors en cohorts addicionals d'AD i plataformes d'EM pot resultar prometedora per avançar en l'estratificació i el tractament del risc d'AD. Els estudis que avaluen el nivell longitudinal d'aquests panells al llarg del temps també són crítics per determinar quina combinació de marcadors estratifica millor el risc de malaltia precoç i els canvis en la gravetat de la malaltia.
Excepte les 3 mostres copiades per CSF, totes les mostres de CSF utilitzades en aquest estudi es van recollir sota els auspicis d'Emory ADRC o institucions de recerca estretament relacionades. En aquests estudis de proteòmica es van utilitzar un total de quatre conjunts de mostres de LCR d'Emory. Es va trobar que la cohort de LCR contenia mostres de 20 controls sans i 20 pacients amb AD. La còpia 1 de CSF inclou mostres de 32 controls sans, 31 individus AsymAD i 33 individus AD. La còpia 2 de CSF conté 147 controls i 150 mostres d'AD. La cohort 4 de replicació de LCR multimalaltia incloïa 18 controls, 17 AD, 19 ALS, 13 PD i 11 mostres de FTD. Segons l'acord aprovat per la Junta de Revisió Institucional de la Universitat d'Emory, tots els participants de l'estudi Emory van obtenir el consentiment informat. Segons les Directrius de bones pràctiques de l'Institut Nacional d'envelliment de 2014 per als centres d'Alzheimer (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), el líquid cefaloraquidi es va recollir i emmagatzemar mitjançant punció lumbar. Control i pacients amb AsymAD i AD van rebre una avaluació cognitiva estandarditzada a la Clínica de Neurologia Cognitiva Emory o l'ADRC de Goizueta. Les seves mostres de líquid cefaloraquidi van ser provades per INNO-BIA AlzBio3 Luminex per a l'anàlisi ELISA Aβ1-42, tau total i p-tau (65). Els valors ELISA s'utilitzen per donar suport a la classificació diagnòstica dels subjectes basant-se en criteris de tall de biomarcadors d'AD establerts (66, 67). També s'obtenen dades demogràfiques i diagnòstiques bàsiques per a altres diagnòstics de LCR (FTD, ALS i PD) d'Emory ADRC o institucions de recerca afiliades. Les metadades del cas resum per a aquests casos de LCR d'Emory es poden trobar a la taula S1A. Les característiques de la cohort suïssa de replicació 3 de CSF s'han publicat prèviament (45).
CSF va trobar la mostra. Per tal d'augmentar la profunditat del nostre descobriment del conjunt de dades de CSF, es va realitzar un consum immunitari de proteïnes d'alta abundància abans de la tripsinització. En resum, es van col·locar 130 μl de CSF de 40 mostres individuals de CSF i un volum igual (130 μl) de resina d'esgotament de proteïnes d'abundància de High Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) en una columna de rotació (Thermo Fisher Scientific, A89868) a l'habitació. temperatura d'incubació). Després de girar durant 15 minuts, centrifugueu la mostra a 1000 g durant 2 minuts. Es va utilitzar un dispositiu de filtre ultracentrífug de 3K (Millipore, UFC500396) per concentrar la mostra de l'efluent centrifugant a 14.000 g durant 30 minuts. Diluir tots els volums de mostra a 75 μl amb solució salina tamponada amb fosfat. La concentració de proteïnes es va avaluar mitjançant el mètode d'àcid bicinconínic (BCA) segons el protocol del fabricant (Thermo Fisher Scientific). El LCR immunodepletat (60 μl) de les 40 mostres es va digerir amb lisil endopeptidasa (LysC) i tripsina. En resum, la mostra es va reduir i es va alquilar amb 1,2 μl de tris-2(-carboxietil)-fosfina 0,5 M i 3 μl de cloroacetamida 0,8 M a 90 °C durant 10 minuts, i després es va sonicar en un bany d'aigua durant 15 minuts. La mostra es va diluir amb 193 μl de tampó d'urea 8 M [urea 8 M i NaHPO4 100 mM (pH 8, 5)] fins a una concentració final de 6 M d'urea. LysC (4,5 μg; Wako) s'utilitza per a la digestió nocturna a temperatura ambient. La mostra es va diluir a urea 1 M amb bicarbonat d'amoni (ABC) 50 mM (68). Afegiu una quantitat igual (4,5 μg) de tripsina (Promega) i, a continuació, incubeu la mostra durant 12 hores. Acidifiqueu la solució peptídica digerida fins a una concentració final d'1% àcid fòrmic (FA) i 0,1% d'àcid trifluoroacètic (TFA) (66), i després dessalineu amb una columna Sep-Pak C18 de 50 mg (Aigües) tal com es descriu anteriorment (25). . A continuació, el pèptid es va eluir en 1 ml d'acetonitril al 50% (ACN). Per estandarditzar la quantificació de proteïnes entre lots (25), es van combinar alíquotes de 100 μl de les 40 mostres de CSF per generar una mostra mixta, que després es va dividir en cinc mostres d'estàndard intern global (GIS) (48). Totes les mostres individuals i els estàndards combinats s'assequen mitjançant un buit d'alta velocitat (Labconco).
CSF copia la mostra. Dayon i els seus col·legues han descrit prèviament l'esgotament immune i la digestió de mostres de còpia 3 de CSF (45, 46). Les mostres rèpliques restants no es van immunodepletar individualment. Digeriu aquestes mostres no eliminades en tripsina tal com es va descriure anteriorment (17). Per a cada anàlisi repetida, es van reunir alíquotes de 120 μl del pèptid eluït de cada mostra i es van dividir en alíquotes de volum igual per utilitzar-les com a estàndard intern global marcat amb TMT (48). Totes les mostres individuals i els estàndards combinats s'assequen mitjançant un buit d'alta velocitat (Labconco). Per tal de millorar el senyal de la proteïna CSF de baixa abundància, combinant 125 μl de cada mostra, es va preparar una mostra "millorada" per a cada anàlisi rèplica [és a dir, una mostra biològica que imita la mostra d'investigació, però la quantitat disponible és molt més gran (37, 69)] es va fusionar en una mostra mixta de LCR (17). A continuació, es va immunoeliminar la mostra barrejada amb 12 ml de resina d'eliminació de proteïnes d'abundància de High Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372), digerida tal com es descriu anteriorment i inclosa en l'etiquetatge TMT múltiple posterior.
Hora de publicació: 27-agost-2021