Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat. Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Els termòfils són microorganismes que es desenvolupen a altes temperatures. Estudiar-los pot proporcionar informació valuosa sobre com s'adapta la vida a condicions extremes. Tanmateix, és difícil aconseguir condicions d'alta temperatura amb microscopis òptics convencionals. S'han proposat diverses solucions casolanes basades en la calefacció elèctrica resistiva local, però no hi ha una solució comercial senzilla. En aquest article, introduïm el concepte d'escalfament làser a microescala sobre el camp de visió del microscopi per proporcionar altes temperatures per als estudis de termòfils mantenint l'entorn de l'usuari suau. L'escalfament a microescala a una intensitat làser moderada es pot aconseguir mitjançant un substrat recobert de nanopartícules d'or com a absorbent de llum biocompatible i eficient. Es discuteixen els possibles efectes de la convecció de fluids a microescala, la retenció de cèl·lules i el moviment termoforètic centrífug. El mètode s'ha demostrat en dues espècies: (i) Geobacillus stearothermophilus, un bacteri termòfil actiu que es reprodueix a uns 65 °C, que hem observat germinar, créixer i nedar sota escalfament a microescala; (ii) Thiobacillus sp., una arquea òptimament hipertermofílica. a 80°C. Aquest treball obre el camí per a una observació senzilla i segura de microorganismes termòfils mitjançant eines de microscòpia modernes i assequibles.
Durant milers de milions d'anys, la vida a la Terra ha evolucionat per adaptar-se a una àmplia gamma de condicions ambientals que de vegades es consideren extremes des de la nostra perspectiva humana. En particular, alguns microorganismes termòfils (bacteris, arqueus, fongs) anomenats termòfils prosperen en el rang de temperatures de 45 °C a 122 °C1, 2, 3, 4. Els termòfils viuen en diversos ecosistemes, com les fonts hidrotermals de les aigües profundes, les aigües termals. o zones volcàniques. La seva investigació ha generat molt d'interès durant les últimes dècades per almenys dos motius. En primer lloc, podem aprendre d'ells, per exemple, com els termòfils 5, 6, els enzims 7, 8 i les membranes 9 són estables a temperatures tan elevades, o com els termòfils poden suportar nivells extrems de radiació10. En segon lloc, són la base de moltes aplicacions biotecnològiques importants1,11,12 com la producció de combustible13,14,15,16, la síntesi química (dihidro, alcohols, metà, aminoàcids, etc.)17, la biomineria18 i els biocatalitzadors termoestables7,11, 13. En particular, la coneguda reacció en cadena de la polimerasa (PCR)19 actualment implica un enzim (Taq polimerasa) aïllat del bacteri termòfil Thermus aquaticus, un dels primers termòfils descoberts.
Tanmateix, l'estudi dels termòfils no és una tasca fàcil i no es pot improvisar en cap laboratori biològic. En particular, els termòfils vius no es poden observar in vitro amb cap microscopi de llum estàndard, fins i tot amb cambres de calefacció disponibles comercialment, normalment classificades per a temperatures tan baixes com 40 °C. Des de la dècada de 1990, només uns quants grups de recerca s'han dedicat a la introducció de sistemes de microscòpia d'alta temperatura (HTM). El 1994 Glukh et al. La cambra de calefacció/refrigeració es va concebre a partir de l'ús d'una cèl·lula Peltier que controla la temperatura dels capil·lars rectangulars tancats per mantenir l'anaerobicitat 20 . El dispositiu es pot escalfar fins a 100 °C a una velocitat de 2 °C/s, cosa que permet als autors estudiar la motilitat del bacteri hipertermofílic Thermotoga maritima21. El 1999 Horn et al. S'ha desenvolupat un dispositiu molt similar, encara basat en l'ús de capil·lars escalfats adequats per a la microscòpia comercial per estudiar la divisió/connexió cel·lular. Després d'un llarg període d'inactivitat relativa, la recerca d'HTM efectius es va reprendre el 2012, en particular en relació amb una sèrie de treballs del grup Wirth que utilitzaven un dispositiu inventat per Horn et al. Fa quinze anys, la motilitat d'un gran nombre d'arquees, inclosos els hipertermòfils, es va estudiar a temperatures de fins a 100 °C mitjançant capil·lars escalfats23,24. També van modificar el microscopi original per aconseguir un escalfament més ràpid (uns quants minuts en lloc de 35 minuts per assolir la temperatura establerta) i aconseguir un gradient de temperatura lineal de més de 2 cm a través del medi. Aquest dispositiu de conformació del gradient de temperatura (TGFD) s'ha utilitzat per estudiar la mobilitat de molts termòfils dins dels gradients de temperatura a distàncies biològicament rellevants 24, 25.
Escalfar capil·lars tancats no és l'única manera d'observar termòfils vius. El 2012, Kuwabara et al. Es van utilitzar cambres de Pyrex d'un sol ús casolanes segellades amb adhesiu resistent a la calor (Super X2; Cemedine, Japó). Les mostres es van col·locar en una placa de calefacció transparent disponible comercialment (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japó) capaç d'escalfar fins a 110 ° C, però no destinada originalment a la bioimatge. Els autors van observar una divisió eficient de bacteris termòfils anaeròbics (Thermosipho globiformans, temps de duplicació de 24 min) a 65 ° C. El 2020, Pulshen et al. Es va demostrar l'escalfament eficient de plats metàl·lics comercials (AttofluorTM, Thermofisher) mitjançant dos elements de calefacció casolans: una tapa i un escenari (configuració inspirada en la màquina de PCR). Aquesta associació dóna lloc a una temperatura líquida uniforme i evita l'evaporació i la condensació a la part inferior de la tapa. L'ús d'una junta tòrica evita l'intercanvi de gasos amb el medi ambient. Aquest HTM, anomenat sulfoscopi, es va utilitzar per a la imatge de Sulfolobus acidocaldarius a 75 °C27.
Una limitació reconeguda de tots aquests sistemes va ser la restricció a l'ús d'objectius d'aire, ja que qualsevol immersió d'oli no era adequada per a una temperatura tan elevada i per a la imatge a través de mostres transparents > 1 mm de gruix. Una limitació reconeguda de tots aquests sistemes va ser la restricció a l'ús d'objectius d'aire, ja que qualsevol immersió d'oli no era adequada per a una temperatura tan elevada i per a la imatge a través de mostres transparents > 1 mm de gruix. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использовататком всех этих систем, ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и зало подходило зрачные образцы толщиной > 1 мм. Una mancança reconeguda de tots aquests sistemes va ser la limitació a l'ús d'objectius d'aire, ja que qualsevol immersió d'oli no era adequada per a una temperatura tan elevada i per a la visualització a través de mostres transparents > 1 mm de gruix.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适吘都不适吘濙适合制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适吘都不适合濙濙适吘濙这适合气物镜毫米厚的透明样品成像。 Una limitació reconeguda de tots aquests sistemes és la limitació de l'ús d'un mirall incorporat per aire, ja que qualsevol immersió en oli no és adequada per obtenir imatges de mostres transparents > 1 mm de gruix a temperatures tan elevades. Ощепризнанны недостатком всех этих систем ржение в масло непригодно для таких ысоких температу и иалализации через прозозе обрр о т т т т т. Un inconvenient reconegut de tots aquests sistemes és l'ús limitat de lents d'aire, qualsevol immersió en oli és inadequada per a temperatures tan elevades i visualització a través de mostres transparents > 1 mm de gruix.Més recentment, aquesta limitació va ser aixecada per Charles-Orzag et al. 28, que va desenvolupar un dispositiu que ja no proporciona calor al voltant del sistema d'interès, sinó més aviat dins del propi vidre de coberta, cobert amb una fina capa transparent d'una resistència feta d'ITO (òxid d'indi-estany). La tapa es pot escalfar fins a 75 °C fent passar un corrent elèctric a través de la capa transparent. Tanmateix, l'autor també ha d'escalfar la lent a l'objectiu, però no més de 65 °C, per no danyar-lo.
Aquests treballs mostren que el desenvolupament d'una microscòpia òptica d'alta temperatura eficient no s'ha adoptat àmpliament, sovint requereix equips casolans i sovint s'aconsegueix a costa de la resolució espacial, la qual cosa és un greu desavantatge donat que els microorganismes termòfils no són més grans que uns quants. micròmetres. La reducció del volum d'escalfament és la clau per resoldre tres problemes inherents a l'HTM: mala resolució espacial, alta inèrcia tèrmica quan el sistema s'escalfa i escalfament nociu dels elements circumdants (oli d'immersió, lent objectiu... o mans de l'usuari) a temperatures extremes. ).
En aquest article, introduïm un HTM per a l'observació de termòfils que no es basa en l'escalfament resistiu. En canvi, vam aconseguir un escalfament localitzat dins d'una regió limitada del camp de visió del microscopi mitjançant la irradiació làser d'un substrat que absorbeix la llum. La distribució de la temperatura es va visualitzar mitjançant microscòpia de fase quantitativa (QPM). L'eficàcia d'aquest mètode està demostrada per Geobacillus stearothermophilus, un bacteri termòfil mòbil que es reprodueix a uns 65 °C i té un curt temps de duplicació (uns 20 minuts), i Sulfolobus shibatae, un hipertermòfil que creix de manera òptima a 80 °C (archaea) per il·lustrar. La taxa de replicació normal i la natació es van observar en funció de la temperatura. Aquest làser HTM (LA-HTM) no està limitat pel gruix del cobreobjectes ni per la naturalesa de l'objectiu (immersió en aire o oli). Això permet utilitzar qualsevol lent d'alta resolució del mercat. Tampoc pateix un escalfament lent a causa de la inèrcia tèrmica (aconsegueix un escalfament instantani a escala de mil·lisegons) i utilitza només components comercials. Les úniques preocupacions de seguretat noves estan relacionades amb la presència de potents raigs làser (normalment de fins a 100 mW) dins del dispositiu i possiblement a través dels ulls, que requereixen ulleres protectores.
El principi de LA-HTM és utilitzar un làser per escalfar la mostra localment dins del camp de visió del microscopi (Fig. 1a). Per fer-ho, la mostra ha d'absorbir la llum. Per utilitzar una potència làser raonable (menys de 100 mW), no ens vam basar en l'absorció de llum pel medi líquid, sinó que vam augmentar artificialment l'absorció de la mostra recobrint el substrat amb nanopartícules d'or (Fig. 1c). L'escalfament de nanopartícules d'or amb llum és d'importància fonamental per al camp de la plasmònica tèrmica, amb aplicacions esperades en biomedicina, nanoquímica o recollida de llum solar29,30,31. Durant els últims anys, hem utilitzat aquest LA-HTM en diversos estudis relacionats amb aplicacions de plasma tèrmic en física, química i biologia. La principal dificultat d'aquest mètode és mostrar el perfil de temperatura final, ja que la temperatura elevada es limita a una regió a microescala dins de la mostra. Hem demostrat que el mapatge de temperatura es pot aconseguir amb l'interferòmetre de cisalla transversal de quatre longituds d'ona, un mètode senzill, d'alta resolució i molt sensible de microscòpia quantitativa de fase basat en l'ús de reixes de difracció bidimensionals (també conegudes com a reixes creuades) 33,34,35,36. La fiabilitat d'aquesta tècnica de microscòpia tèrmica, basada en la microscòpia de front d'ona de reixeta creuada (CGM), s'ha demostrat en una dotzena d'articles publicats durant l'última dècada37,38,39,40,41,42,43.
Esquema d'instal·lació de microscopi làser paral·lel de calefacció, conformació i temperatura. b Geometria de la mostra que consisteix en una cambra AttofluorTM que conté un cobreobjectes recobert amb nanopartícules d'or. c Mireu bé la mostra (no a escala). d representa el perfil uniforme del feix làser i (e) la distribució de temperatura posterior simulada al pla de mostra de les nanopartícules d'or. f és un perfil de raig làser anular adequat per generar una temperatura uniforme tal com es mostra a la simulació de la distribució de temperatura resultant que es mostra a (g). Barra d'escala: 30 µm.
En particular, recentment hem aconseguit l'escalfament de cèl·lules de mamífer amb LA-HTM i CGM i hem seguit les respostes de xoc tèrmic cel·lular en el rang de 37-42 ° C, demostrant l'aplicabilitat d'aquesta tècnica a la imatge de cèl·lules vives individuals. No obstant això, l'aplicació de LA-HTM a l'estudi de microorganismes a altes temperatures no és inequívoca, ja que requereix més precaució en comparació amb les cèl·lules de mamífers: en primer lloc, escalfar el fons del medi en desenes de graus (en lloc d'uns pocs graus) comporta a un fort gradient de temperatura vertical. pot crear una convecció de fluids 44 que, si no s'adhereix fermament al substrat, pot provocar moviments indesitjables i barreja de bacteris. Aquesta convecció es pot eliminar reduint el gruix de la capa líquida. Amb aquesta finalitat, en tots els experiments que es presenten a continuació, es van col·locar suspensions bacterianes entre dos cobreobjectes d'uns 15 µm de gruix col·locats dins d'una copa metàl·lica (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). En principi, la convecció es pot evitar si el gruix del líquid és menor que la mida del feix del làser de calefacció. En segon lloc, treballar amb una geometria tan limitada pot sufocar els organismes aeròbics (vegeu la figura S2). Aquest problema es pot evitar utilitzant un substrat permeable a l'oxigen (o qualsevol altre gas vital), deixant bombolles d'aire atrapades a l'interior del cobreobjectes o fent forats a la part superior del cobreobjectes (vegeu la figura S1) 45 . En aquest estudi, vam triar l'última solució (figures 1b i S1). Finalment, la calefacció per làser no proporciona una distribució uniforme de la temperatura. Fins i tot a la mateixa intensitat del feix làser (Fig. 1d), la distribució de la temperatura no és uniforme, sinó que s'assembla a la distribució gaussiana a causa de la difusió tèrmica (Fig. 1e). Quan l'objectiu és establir temperatures precises en el camp de visió per estudiar sistemes biològics, els perfils desiguals no són ideals i també poden provocar un moviment termoforètic dels bacteris si no s'adhereixen al substrat (vegeu Fig. S3, S4)39. Amb aquesta finalitat, hem utilitzat un modulador de llum espacial (SLM) per donar forma al feix làser infrarojo segons la forma de l'anell (Fig. 1f) en el pla de la mostra per aconseguir una distribució de temperatura perfectament uniforme dins d'una àrea geomètrica determinada, malgrat la difusió tèrmica (Fig. 1d) 39 , 42, 46. Col·loqueu un cobreobjectes superior sobre un plat metàl·lic (Figura 1b) per evitar l'evaporació del medi i observeu almenys uns dies. Com que aquest cobreobjectes superior no està segellat, es pot afegir un mitjà addicional fàcilment en qualsevol moment si cal.
Per il·lustrar com funciona LA-HTM i demostrar la seva aplicabilitat en la investigació termòfila, hem estudiat els bacteris aeròbics Geobacillus stearothermophilus, que tenen una temperatura de creixement òptima d'uns 60-65 °C. El bacteri també té flagels i la capacitat de nedar, proporcionant un altre indicador de l'activitat cel·lular normal.
Les mostres (Fig. 1b) es van preincubar a 60 ° C durant una hora i després es van col·locar en un suport de mostres LA-HTM. Aquesta preincubació és opcional, però encara útil, per dos motius: primer, quan s'encén el làser, fa que les cèl·lules creixin i es divideixin immediatament (vegeu la pel·lícula M1 a Materials suplementaris). Sense pre-incubació, el creixement bacterià normalment es retarda uns 40 minuts cada vegada que s'escalfa una nova àrea de visualització a la mostra. En segon lloc, la pre-incubació d'1 hora va promoure l'adhesió dels bacteris al cobreobjectes, evitant que les cèl·lules s'allunyessin del camp de visió a causa de la termoforesi quan es va encendre el làser (vegeu la pel·lícula M2 a Materials suplementaris). La termoforesi és el moviment de partícules o molècules al llarg d'un gradient de temperatura, generalment de calent a fred, i els bacteris no són una excepció43,47. Aquest efecte indesitjable s'elimina en una àrea determinada mitjançant l'ús de SLM per donar forma al feix làser i aconseguir una distribució plana de la temperatura.
A la fig. La figura 2 mostra la distribució de temperatura mesurada per CGM obtinguda irradiant un substrat de vidre recobert de nanopartícules d'or amb un feix làser anular (Fig. 1f). Es va observar una distribució plana de la temperatura a tota l'àrea coberta pel raig làser. Aquesta zona es va establir a 65 ° C, la temperatura de creixement òptima. Fora d'aquesta regió, la corba de temperatura cau naturalment a \(1/r\) (on \(r\) és la coordenada radial).
un Mapa de temperatura de mesures de CGM obtinguts mitjançant l'ús d'un raig làser anular per irradiar una capa de nanopartícules d'or per obtenir un perfil de temperatura pla sobre una àrea circular. b Isoterma del mapa de temperatures (a). El contorn del raig làser està representat per un cercle de punts grisos. L'experiment es va repetir dues vegades (vegeu Materials suplementaris, figura S4).
La viabilitat de les cèl·lules bacterianes es va controlar durant diverses hores mitjançant LA-HTM. A la fig. 3 mostra l'interval de temps per a quatre imatges preses d'una pel·lícula de 3 hores i 20 minuts (pel·lícula M3, informació suplementària). Es va observar que els bacteris proliferaven activament dins de l'àrea circular definida pel làser on la temperatura era òptima, aproximant-se als 65 °C. En canvi, el creixement cel·lular es va reduir significativament quan la temperatura va caure per sota dels 50 ° C durant 10 s.
Imatges de profunditat òptica de bacteris G. stearothermophilus que creixen després de l'escalfament làser en diferents moments, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, fora de 200 Extret d'una pel·lícula d'un minut (pel·lícula M3 proporcionada a la informació complementària) superposada al mapa de temperatures corresponent. El làser s'encén al temps \(t=0\). S'han afegit isotermes a la imatge d'intensitat.
Per quantificar encara més el creixement cel·lular i la seva dependència de la temperatura, vam mesurar l'augment de la biomassa de diverses colònies de bacteris inicialment aïllats al camp de visió de la pel·lícula M3 (Fig. 4). Els bacteris pares seleccionats a l'inici de la formació d'unitats formadores de mini colònies (mCFU) es mostren a la figura S6. Les mesures de massa seca es van fer amb una càmera CGM 48 que es va utilitzar per mapejar la distribució de la temperatura. La capacitat del CGM per mesurar el pes sec i la temperatura és la força del LA-HTM. Com era d'esperar, la temperatura elevada va provocar un creixement bacterià més ràpid (Fig. 4a). Tal com es mostra a la gràfica semi-log de la figura 4b, el creixement a totes les temperatures segueix el creixement exponencial, on les dades utilitzen la funció exponencial \(m={m}_{0}{10}^{t/\tau}+ {{ \mbox{cst}}}\), on \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) - temps de generació (o temps de duplicació), \( g =1/ \tau\) – taxa de creixement (nombre de divisions per unitat de temps). A la fig. La figura 4c mostra la taxa de creixement i el temps de generació respectius en funció de la temperatura. Els mCFU de creixement ràpid es caracteritzen per la saturació del creixement després de dues hores, un comportament esperat a causa de l'alta densitat bacteriana (similar a la fase estacionària en cultius líquids clàssics). La forma general \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) correspon a la corba de dues fases esperada per a G. stearothermophilus amb una taxa de creixement òptima al voltant dels 60-65 °C. Relaciona les dades utilitzant un model cardinal (figura S5)49 on \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, que coincideix bé amb altres valors citats a la literatura49. Tot i que els paràmetres depenents de la temperatura són reproduïbles, la taxa de creixement màxima de \({G}_{0}\) pot variar d'un experiment a un altre (vegeu les figures S7-S9 i la pel·lícula M4). A diferència dels paràmetres d'ajust de temperatura, que haurien de ser universals, la taxa de creixement màxima depèn de les propietats del medi (disponibilitat de nutrients, concentració d'oxigen) dins de la geometria a microescala observada.
a Creixement microbià a diferents temperatures. mCFU: Unitats de formació de colònies en miniatura. Dades obtingudes d'un vídeo d'un sol bacteri creixent en un gradient de temperatura (pel·lícula M3). b Igual que (a), escala semilogarítmica. c Taxa de creixement\(\tau\) i temps de generació\(g\) calculats a partir de la regressió lineal (b). Barres d'error horitzontals: rang de temperatura sobre el qual els mCFU es van expandir al camp de visió durant el creixement. Barres d'error verticals: error estàndard de regressió lineal.
A més del creixement normal, alguns bacteris de vegades suren a la vista durant l'escalfament làser, que és un comportament esperat per als bacteris amb flagels. La pel·lícula M5 en informació addicional mostra aquestes activitats de natació. En aquest experiment, es va utilitzar una radiació làser uniforme per crear un gradient de temperatura, tal com es mostra a les figures 1d, e i S3. La figura 5 mostra dues seqüències d'imatges seleccionades de la pel·lícula M5 que mostren que un bacteri presenta un moviment direccional mentre que tots els altres bacteris romanen immòbils.
Els dos períodes de temps (a) i (b) mostren la natació de dos bacteris diferents marcats amb cercles de punts. Les imatges es van extreure de la pel·lícula M5 (proporcionada com a material suplementari).
En el cas de G. stearothermophilus, el moviment actiu dels bacteris (Fig. 5) va començar uns segons després d'encendre el raig làser. Aquesta observació posa èmfasi en la resposta temporal d'aquest microorganisme termòfil a un augment de la temperatura, tal com ja va observar Mora et al. 24 . El tema de la motilitat bacteriana i fins i tot la termotaxi es pot explorar més a fons mitjançant LA-HTM.
La natació microbiana no s'ha de confondre amb altres tipus de moviment físic, a saber (i) el moviment brownià, que sembla ser un moviment caòtic sense direcció definida, (ii) la convecció 50 i la termoforesi 43, que consisteix en una deriva regular del moviment al llarg d'una temperatura. gradient.
G. stearothermophilus és conegut per la seva capacitat de produir espores altament resistents (formació d'espores) quan s'exposa a condicions ambientals adverses com a defensa. Quan les condicions ambientals tornen a ser favorables, les espores germinen, formant cèl·lules vives i reprenent el creixement. Tot i que aquest procés d'esporulació/germinació és ben conegut, mai s'ha observat en temps real. Utilitzant LA-HTM, informem aquí de la primera observació dels esdeveniments de germinació en G. stearothermophilus.
A la fig. La figura 6a mostra imatges de lapse de temps de profunditat òptica (OT) obtingudes mitjançant un conjunt CGM de 13 espores. Durant tot el temps de recollida (15 h 6 min, \(t=0\) - l'inici de l'escalfament làser), 4 de les 13 espores van germinar, en punts de temps successius \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' i \(11\) h \(30\)'. Tot i que a la figura 6 només es mostra un d'aquests esdeveniments, es poden observar 4 esdeveniments de germinació a la pel·lícula M6 al material suplementari. Curiosament, la germinació sembla ser aleatòria: no totes les espores germinen i no germinen al mateix temps, malgrat els mateixos canvis en les condicions ambientals.
a Time-lapse format per 8 imatges OT (immersió en oli, 60x, objectiu 1,25 NA) i (b) evolució de la biomassa dels agregats de G. stearothermophilus. c (b) Dibuixat a escala semi-logarítmica per ressaltar la linealitat de la taxa de creixement (línia discontínua).
A la fig. La figura 6b,c mostra la biomassa de les poblacions cel·lulars al camp de visió en funció del temps durant tot el període de recollida de dades. La ràpida decadència de la massa seca observada a \(t=5\)h a la fig. 6b, c, a causa de la sortida d'algunes cèl·lules del camp de visió. La taxa de creixement d'aquests quatre esdeveniments és \(0,77\pm 0,1\) h-1. Aquest valor és superior a la taxa de creixement associada a la figura 3. 3 i 4, on les cèl·lules creixen normalment. El motiu de l'augment de la taxa de creixement de G. stearothermophilus a partir d'espores no està clar, però aquestes mesures posen de manifest l'interès de LA-HTM i treballen a nivell de cèl·lula única (o a nivell de mCFU únic) per obtenir més informació sobre la dinàmica de la vida cel·lular. .
Per demostrar encara més la versatilitat de LA-HTM i el seu rendiment a altes temperatures, vam examinar el creixement de Sulfolobus shibatae, una arquea acidòfila hipertermofílica amb una temperatura de creixement òptima de 80 ° C51. En comparació amb G. stearothermophilus, aquestes arquees també tenen una morfologia molt diferent, semblant-se a esferes d'1 micra (cocs) més que a bastons allargats (bacils).
La figura 7a consta d'imatges de profunditat òptica seqüencial de S. shibatae mCFU obtingudes mitjançant CGM (vegeu el llargmetratge M7 a Materials suplementaris). Aquest mCFU creix al voltant dels 73 °C, per sota de la temperatura òptima de 80 °C, però dins del rang de temperatura per al creixement actiu. Vam observar múltiples esdeveniments de fissió que van fer que els mCFU semblins microraïms d'arquea al cap d'unes hores. A partir d'aquestes imatges OT, es va mesurar la biomassa mCFU al llarg del temps i es va presentar a la figura 7b. Curiosament, els mCFU de S. shibatae van mostrar un creixement lineal en lloc del creixement exponencial vist amb els mCFU de G. stearothermophilus. Hi ha hagut una discussió llarga 52 sobre la naturalesa de les taxes de creixement cel·lular: mentre que alguns estudis informen de taxes de creixement de microbis que són proporcionals a la seva mida (creixement exponencial), altres mostren una taxa constant (creixement lineal o bilineal). Tal com expliquen Tzur et al.53, distingir entre creixement exponencial i (bi)lineal requereix una precisió <6% en les mesures de biomassa, que està fora de l'abast de la majoria de tècniques QPM, fins i tot amb interferometria. Tal com expliquen Tzur et al.53, distingir entre creixement exponencial i (bi)lineal requereix una precisió <6% en les mesures de biomassa, que està fora de l'abast de la majoria de tècniques QPM, fins i tot amb interferometria. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста третение экспоненциального и (би)линейного роста третом 6 % х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интеримерфериромерф. Tal com expliquen Zur et al.53, distingir entre creixement exponencial i (bi)lineal requereix una precisió <6% en les mesures de biomassa, que és inassolible per a la majoria de mètodes QPM, fins i tot utilitzant interferometria.Tal com expliquen Zur et al. 53, distingir entre creixement exponencial i (bi)lineal requereix una precisió inferior al 6% en les mesures de biomassa, que és inassolible per a la majoria dels mètodes QPM, fins i tot quan s'utilitza interferometria. CGM aconsegueix aquesta precisió amb una precisió sub-pg en les mesures de biomassa36,48.
un Time-lapse format per 6 imatges OT (immersió en oli, 60x, objectiu NA 1.25) i (b) evolució de la biomassa micro-CFU mesurada amb CGM. Vegeu la pel·lícula M7 per obtenir més informació.
El creixement perfectament lineal de S. shibatae va ser inesperat i encara no s'ha informat. Tanmateix, s'espera un creixement exponencial, almenys perquè amb el temps s'han de produir múltiples divisions de 2, 4, 8, 16... cèl·lules. Vam plantejar la hipòtesi que el creixement lineal podria ser degut a la inhibició cel·lular a causa de l'empaquetament cel·lular dens, de la mateixa manera que el creixement cel·lular s'alenteix i finalment arriba a un estat latent quan la densitat cel·lular és massa alta.
Acabem discutint al seu torn els cinc punts d'interès següents: reducció del volum d'escalfament, reducció de la inèrcia tèrmica, interès per les nanopartícules d'or, interès per la microscòpia de fase quantitativa i un possible rang de temperatura en què es pot utilitzar LA-HTM.
En comparació amb l'escalfament resistiu, l'escalfament làser utilitzat per al desenvolupament d'HTM ofereix diversos avantatges, que il·lustrem en aquest estudi. En particular, en mitjans líquids al camp de visió del microscopi, el volum d'escalfament es manté en uns pocs (10 μm) 3 volums. D'aquesta manera, només els microbis observats estan actius, mentre que altres bacteris estan latents i es poden utilitzar per estudiar més la mostra; no cal canviar la mostra cada vegada que cal comprovar una nova temperatura. A més, l'escalfament a microescala permet l'examen directe d'una àmplia gamma de temperatures: la figura 4c es va obtenir a partir d'una pel·lícula de 3 hores (pel·lícula M3), que sol requerir la preparació i l'examen de diverses mostres, una per a cadascuna de les mostres en estudi. y és la temperatura que representa el nombre de dies de l'experiment. La reducció del volum escalfat també manté tots els components òptics circumdants del microscopi, especialment la lent de l'objectiu, a temperatura ambient, que ha estat un problema important amb què s'ha enfrontat la comunitat fins ara. LA-HTM es pot utilitzar amb qualsevol lent, incloses les lents d'immersió en oli, i es mantindrà a temperatura ambient fins i tot amb temperatures extremes al camp de visió. La principal limitació del mètode d'escalfament làser que informem en aquest estudi és que les cèl·lules que no s'adhereixen o floten poden estar lluny del camp de visió i difícils d'estudiar. Una solució alternativa podria ser utilitzar lents de baix augment per aconseguir un augment de temperatura més gran que superi els pocs centenars de micres. Aquesta precaució va acompanyada d'una disminució de la resolució espacial, però si l'objectiu és estudiar el moviment dels microorganismes, no és necessària una alta resolució espacial.
L'escala de temps per escalfar (i refredar) el sistema \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) depèn de la seva mida, segons la llei \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), on \ (L\) és la mida característica de la font de calor (el diàmetre del feix làser al nostre estudi és \(L\ uns 100\) μm), \(D\) és la difusivitat tèrmica de l'entorn (mitjana en el nostre estudi). cas, vidre i aigua Velocitat de difusió\(D\ aproximadament 2\{10}^{-7}\) m2/s Per tant, en aquest estudi, respostes temporals de l'ordre de 50 ms, és a dir, quasi instantànies). Es poden esperar canvis de temperatura. Aquest establiment instantani de l'augment de la temperatura no només escurça la durada de l'experiment, sinó que també permet un temps precís \(t=0\) per a qualsevol estudi dinàmic dels efectes de la temperatura.
El nostre mètode proposat és aplicable a qualsevol substrat que absorbeixi la llum (per exemple, mostres comercials amb recobriment ITO). Tanmateix, les nanopartícules d'or són capaços de proporcionar una alta absorció en l'infraroig i una baixa absorció en el rang visible, les últimes característiques de les quals són d'interès per a l'observació òptica eficaç en el rang visible, especialment quan s'utilitza fluorescència. A més, l'or és biocompatible, químicament inert, la densitat òptica es pot ajustar des de 530 nm a l'infraroig proper, i la preparació de la mostra és senzilla i econòmica29.
La microscòpia de front d'ona de reixeta transversal (CGM) permet no només el mapeig de temperatura a microescala, sinó també el seguiment de la biomassa, cosa que la fa especialment útil (si no és necessària) en combinació amb LA-HTM. Durant l'última dècada, s'han desenvolupat altres tècniques de microscòpia de temperatura, especialment en el camp de la bioimatge, i la majoria d'elles requereixen l'ús de sondes fluorescents sensibles a la temperatura54,55. Tanmateix, aquests mètodes han estat criticats i alguns informes han mesurat canvis de temperatura poc realistes dins de les cèl·lules, possiblement a causa del fet que la fluorescència depèn de molts factors diferents de la temperatura. A més, la majoria de les sondes fluorescents són inestables a altes temperatures. Per tant, QPM i en particular CGM representen una tècnica de microscòpia de temperatura ideal per estudiar la vida a altes temperatures mitjançant microscòpia òptica.
Els estudis de S. shibatae, que viuen de manera òptima a 80 °C, mostren que LA-HTM es pot aplicar per estudiar hipertermòfils, no només termòfils simples. En principi, no hi ha límit en el rang de temperatures que es pot assolir amb LA-HTM, i fins i tot es poden assolir temperatures superiors als 100 °C a pressió atmosfèrica sense bullir, tal com demostra el nostre grup de 38 en aplicacions de química hidrotermal a l'atmosfera. pressió A. S'utilitza un làser per escalfar nanopartícules d'or 40 de la mateixa manera. Per tant, LA-HTM té el potencial de ser utilitzat per observar hipertermòfils sense precedents amb microscòpia òptica estàndard d'alta resolució en condicions estàndard (és a dir, sota estrès ambiental).
Tots els experiments es van realitzar amb un microscopi casolà, inclosa la il·luminació Köhler (amb LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), porta mostres amb moviment manual xy, objectius (Olympus, 60x, 0,7 NA, aire, LUCPlanFLN60X o 60x, 1,25 NA, oli). , UPLFLN60XOI), càmera CGM (reixa creuada QLSI, pas de 39 µm, 0,87 mm del sensor de càmera Andor Zyla) per proporcionar imatges d'intensitat i front d'ona, i càmera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mode de 16 bits, de Hamamatsu) per gravar el dades que es mostren a la figura 5 (natació bacteriana). El divisor de feix dicroic és una vora BrightLine de 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). El filtre de la part frontal de la càmera és un filtre de pas curt 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Làser de safir de titani (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, cavitat làser bombejada per tsunami, Spectra-Physics a la figura 2-5, més substituït per làser Millenia, Spectraphysics 10 W, cavitat làser Mira bombeada, Coherent, per a la figura 2). -5). 6 i 7) s'estableixen a la longitud d'ona \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, que correspon a l'espectre de ressonància plasmònica de les nanopartícules d'or. Moduladors espacials de llum (1920 × 1152 píxels) es van comprar a Meadowlark Optics. Els hologrames es van calcular mitjançant l'algoritme de Gerchberg-Saxton, tal com es descriu a l'enllaç 39.
La microscòpia de front d'ona de reixeta creuada (CGM) és una tècnica de microscòpia òptica basada en la combinació d'una reixa de difracció bidimensional (també coneguda com a reixeta creuada) a una distància d'un mil·límetre del sensor d'una càmera convencional. L'exemple més comú d'un CGM que hem utilitzat en aquest estudi s'anomena interferòmetre de desplaçament transversal de quatre longituds d'ona (QLSI), on la reixeta creuada consisteix en un patró d'escacs d'intensitat/fase introduït i patentat per Primot et al. el 200034. Les línies de reixeta verticals i horitzontals creen ombres en forma de quadrícula al sensor, la distorsió de les quals es pot processar numèricament en temps real per obtenir la distorsió del front d'ona òptic (o el perfil de fase equivalent) de la llum incident. Quan s'utilitza en un microscopi, una càmera CGM pot mostrar la diferència del camí òptic d'un objecte d'imatge, també coneguda com a profunditat òptica (OT), amb una sensibilitat de l'ordre dels nanòmetres36. En qualsevol mesura de CGM, per eliminar qualsevol defecte en els components òptics o els feixos, s'ha de prendre una imatge OT de referència primària i restar-la de les imatges posteriors.
La microscòpia de temperatura es va realitzar mitjançant una càmera CGM tal com es descriu a la referència. 32. En resum, escalfar un líquid modifica el seu índex de refracció, creant un efecte de lent tèrmica que distorsiona el feix incident. Aquesta distorsió del front d'ona es mesura pel CGM i es processa mitjançant un algorisme de deconvolució per obtenir una distribució de temperatura tridimensional en el medi líquid. Si les nanopartícules d'or es distribueixen uniformement per tota la mostra, el mapeig de temperatura es pot fer en zones lliures de bacteris per produir millors imatges, que és el que fem de vegades. La imatge CGM de referència es va adquirir sense escalfar (amb el làser apagat) i posteriorment es va capturar al mateix lloc de la imatge amb el làser encès.
La mesura de la massa seca s'aconsegueix mitjançant la mateixa càmera CGM que s'utilitza per a la imatge de temperatura. Les imatges de referència de CGM es van obtenir movent ràpidament la mostra en x i y durant l'exposició com a mitjà per fer la mitjana de qualsevol inhomogeneïtat a l'OT a causa de la presència de bacteris. A partir d'imatges OT de bacteris, la seva biomassa es va obtenir mitjançant un conjunt d'imatges sobre àrees seleccionades mitjançant l'algorisme de segmentació casolà de Matlab (vegeu la subsecció "Codi numèric"), seguint el procediment descrit a la ref. 48. En resum, fem servir la relació \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), on \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) és la imatge de profunditat òptica, \(m\) és el pes sec i \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) és una constant. Hem escollit \({{{{\rm{\alpha})))))=0,18\) µm3/pg, que és una constant típica de les cèl·lules vives.
Es va col·locar un cobertor de 25 mm de diàmetre i 150 µm de gruix recobert de nanopartícules d'or en una cambra AttofluorTM (Thermofisher) amb les nanopartícules d'or cap amunt. Geobacillus stearothermophilus es va precultivar durant la nit en medi LB (200 rpm, 60 ° C) abans de cada dia d'experiments. Es va col·locar una gota de 5 µl d'una suspensió de G. stearothermophilus amb una densitat òptica (DO) de 0,3 a 0,5 sobre un cobreobjectes amb nanopartícules d'or. A continuació, es va deixar caure a la gota una coberta rodona de 18 mm de diàmetre amb un forat de 5 mm de diàmetre al centre i es va aplicar repetidament 5 μl de suspensió bacteriana amb la mateixa densitat òptica al centre del forat. Els pous dels cobreobjectes es van preparar d'acord amb el procediment descrit a la ref. 45 (vegeu Informació complementària per a més informació). A continuació, afegiu 1 ml de mitjà LB al cobreobjectes per evitar que la capa líquida s'assequi. L'últim cobrellit es col·loca sobre la tapa tancada de la cambra Attofluor™ per evitar l'evaporació del medi durant la incubació. Per als experiments de germinació, vam utilitzar espores que, després dels experiments convencionals, de vegades cobrien el cobreobjectes superior. Es va utilitzar un mètode similar per obtenir Sulfolobus shibatae. Es van dur a terme tres dies (200 rpm, 75 °C) de cultiu preliminar de Thiobacillus serrata en medi 182 (DSMZ).
Es van preparar mostres de nanopartícules d'or mitjançant litografia de copolímers de blocs micel·lars. Aquest procés es descriu detalladament al cap. 60. Breument, es van sintetitzar micel·les que encapsulaven ions d'or barrejant el copolímer amb HAuCl4 en toluè. A continuació, els cobreobjectes netejats es van submergir a la solució i es van tractar amb irradiació UV en presència d'un agent reductor per obtenir llavors d'or. Finalment, es van cultivar llavors d'or posant en contacte un cobertor amb una solució aquosa de KAuCl4 i etanolamina durant 16 minuts, cosa que va donar lloc a una disposició quasi periòdica i molt uniforme de nanopartícules d'or no esfèriques a l'infraroig proper.
Per convertir els interferogrames en imatges OT, hem utilitzat un algorisme casolà, tal com es detalla a l'enllaç. 33 i està disponible com a paquet de Matlab al següent repositori públic: https://github.com/baffou/CGMprocess. El paquet pot calcular la intensitat i les imatges OT basant-se en els interferogrames enregistrats (incloses les imatges de referència) i les distàncies de la matriu de càmeres.
Per calcular el patró de fase aplicat a SLM per obtenir un perfil de temperatura determinat, hem utilitzat un algorisme casolà desenvolupat prèviament39,42 que està disponible al següent repositori públic: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. L'entrada és el camp de temperatura desitjat, que es pot configurar digitalment o mitjançant una imatge bmp monocroma.
Per segmentar les cèl·lules i mesurar-ne el pes sec, hem utilitzat el nostre algorisme de Matlab publicat al següent repositori públic: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. A cada imatge, l'usuari ha de fer clic al bacteri o mCFU d'interès, ajustar la sensibilitat de la vareta i confirmar la selecció.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de l'Informe de recerca sobre la natura enllaçat a aquest article.
Les dades que donen suport als resultats d'aquest estudi estan disponibles dels autors respectius a petició raonable.
El codi font utilitzat en aquest estudi es detalla a la secció Mètodes, i les versions de depuració es poden descarregar des de https://github.com/baffou/ als dipòsits següents: SLM_temperatureShaping, CGMprocess i CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Informació sobre els termòfils i les seves aplicacions d'ampli espectre. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Informació sobre els termòfils i les seves aplicacions d'ampli espectre.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Visió general dels termòfils i la seva àmplia aplicació. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. i Sharma AK Una profunda comprensió dels termòfils i una àmplia gamma d'aplicacions.3 Biotecnologia 6, 81 (2016).
Hora de publicació: 26-set-2022